Mahalagang Pagkakaiba – NGS vs Sanger Sequencing
Next Generation Sequencing (NGS) at Sanger Sequencing ay dalawang uri ng nucleotide sequencing techniques na binuo sa paglipas ng panahon. Ang paraan ng Sanger Sequencing ay malawakang ginamit sa loob ng maraming taon at pinalitan ito ng NGS kamakailan dahil sa mga pakinabang nito. Ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng NGS at Sanger Sequencing ay ang NGS ay gumagana sa prinsipyo ng pagkakasunud-sunod ng milyun-milyong pagkakasunud-sunod nang sabay-sabay sa mabilis na paraan sa pamamagitan ng isang sequencing system habang ang Sanger Sequencing ay gumagana sa prinsipal ng pagwawakas ng chain dahil sa pumipili na pagsasama ng dideoxynucleotides ng DNA polymerase enzyme. sa panahon ng pagtitiklop ng DNA at nagresulta sa paghihiwalay ng fragment sa pamamagitan ng capillary electrophoresis.
Ano ang Nucleotide Sequencing?
Ang genetic na impormasyon ay nakaimbak sa mga nucleotide sequence ng DNA o RNA ng isang organismo. Ang proseso ng pagtukoy sa tamang pagkakasunud-sunod ng mga nucleotide (gamit ang apat na base) sa isang partikular na fragment (sa isang gene, kumpol ng mga gene, chromosome, at kumpletong genome) ay kilala bilang nucleotide sequencing. Napakahalaga sa genomic studies, forensic studies, virology, biological systematic, medical diagnosis, biotechnology at sa maraming iba pang larangan upang pag-aralan ang istraktura at paggana ng mga gene. Mayroong iba't ibang uri ng mga pamamaraan ng sequencing na binuo ng mga siyentipiko. Kabilang sa mga ito, ang Sanger sequencing na binuo ni Frederick Sanger noong 1977 ay malawakang ginamit at pinasikat sa mahabang panahon hanggang sa pinalitan ito ng Next Generation Sequencing.
Ano ang NGS?
Ang Next Generation Sequencing (NGS) ay isang terminong ginamit upang tukuyin ang mga modernong proseso ng high throughput sequencing. Inilalarawan nito ang ilang iba't ibang modernong teknolohiya sa pagkakasunud-sunod na nagbago ng genomic na pag-aaral at Molecular Biology. Ang mga diskarteng iyon ay ang pagkakasunud-sunod ng Illumina, pagkakasunud-sunod ng Roche 454, pagkakasunud-sunod ng Ion Proton at pagkakasunud-sunod ng SOLiD (Pagkasunud-sunod ng Oligo Ligation Detection). Ang mga sistema ng NGS ay mas mabilis at mas mura. Apat na pangunahing paraan ng sequencing ng DNA ang ginagamit sa mga sistema ng NGS lalo; pyrosequencing, sequencing sa pamamagitan ng synthesis, sequencing sa pamamagitan ng ligation at ion semiconductor sequencing. Ang isang malaking bilang ng mga hibla ng DNA o RNA (milyon-milyong) ay maaaring magkasunod-sunod nang magkatulad. Nagbibigay-daan ito sa pagkakasunud-sunod ng buong genome ng mga organismo sa loob ng maikling panahon, hindi tulad ng Sanger sequencing na tumatagal ng mas maraming oras.
Ang NGS ay may maraming pakinabang kaysa sa kumbensyonal na sequencing na paraan ng Sanger. Ito ay isang mataas na bilis, mas tumpak at cost-effective na proseso na maaaring isagawa gamit ang maliit na sample size. Maaaring gamitin ang NGS sa metagenomic na pag-aaral, sa pagtuklas ng mga pagkakaiba-iba sa loob ng isang indibidwal na genome dahil sa mga pagpapasok at pagtanggal atbp. at sa pagsusuri ng mga expression ng gene.
Figure_1: Mga Pag-unlad sa NGS Sequencing
Ano ang Sanger Sequencing?
Ang Sanger Sequencing ay isang paraan ng sequencing na binuo ni Frederick Sanger at ng kanyang mga kasamahan noong 1977 upang matukoy ang tumpak na pagkakasunud-sunod ng nucleotide ng isang partikular na fragment ng DNA. Ito ay kilala rin bilang chain termination sequencing o Dideoxy sequencing. Ang gumaganang prinsipyo ng pamamaraang ito ay ang pagwawakas ng strand synthesis sa pamamagitan ng selective incorporation ng isang chain terminating dideoxynucleotides (ddNTPs) tulad ng ddGTP, ddCTP, ddATP at ddTTP ng DNA polymerase sa panahon ng pagtitiklop ng DNA. Ang mga normal na nucleotide ay may 3' OH na grupo para sa pagbuo ng isang phosphodiester bond sa pagitan ng mga katabing nucleotides upang ipagpatuloy ang pagbuo ng strand. Gayunpaman, ang mga ddNTP ay kulang sa 3' OH na pangkat na ito at hindi makabuo ng mga phosphodiester bond sa pagitan ng mga nucleotide. Kaya, ang pagpapahaba ng kadena ay tumigil.
Sa pamamaraang ito, ang solong-stranded na DNA na isa-sequence ay nagsisilbing template strand para sa in vitro DNA synthesis. Ang iba pang mga kinakailangan ay oligonucleotide primer, deoxynucleotide precursors at DNA polymerase enzyme. Kapag nalaman ang mga gilid na dulo ng target na fragment, ang mga panimulang aklat ay madaling idisenyo para sa pagtitiklop ng DNA. Apat na magkahiwalay na reaksyon ng synthesis ng DNA ang ginagawa sa apat na magkahiwalay na tubo. Ang bawat tubo ay may hiwalay na mga ddNTP, kasama ng iba pang mga kinakailangan. Mula sa partikular na nucleotide, isang halo ng mga dNTP at ddNTP ay idinagdag. Gayundin, apat na magkahiwalay na reaksyon ang ginagawa sa apat na tubo na may apat na mixture. Pagkatapos ng mga reaksyon, ang pagtuklas ng mga fragment ng DNA at pag-convert ng pattern ng fragment sa sequence information ay ginaganap. Ang nagreresultang mga fragment ng DNA ay heat denatured at pinaghihiwalay ng gel electrophoresis. Kung gagamitin ang radioactive nucleotides, ang pattern ng banding sa polyacrylamide gel ay maaaring makita sa pamamagitan ng autoradiography. Kapag ang pamamaraang ito ay gumagamit ng fluorescently tagged dideoxynucleotides, maaari itong mabawasan ang gel na nabasa at dumaan sa isang sinag ng laser upang matukoy ng fluorescent detector. Upang maiwasan ang mga error na maaaring lumitaw kapag ang isang sequence ay binasa ng mata at manu-manong ipinasok sa isang computer, ang paraang ito ay binuo sa paggamit ng automated sequencer na isinama sa computer.
Ito ang paraan na ginamit upang i-sequence ang DNA mula sa proyekto ng Human Genome. Ginagamit pa rin ang paraang ito sa mga advanced na pagbabago dahil nagbibigay ito ng tumpak na impormasyon sa pagkakasunud-sunod sa kabila ng pagiging mahal at mabagal na proseso.
Figure_2: Sanger Sequencing
Ano ang pagkakaiba ng NGS at Sanger Sequencing?
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Ang Next Generation Sequencing (NGS) ay tumutukoy sa mga modernong proseso ng high throughput sequencing. Inilalarawan nito ang ilang iba't ibang makabagong teknolohiya sa pagkakasunud-sunod | Ang Sanger Sequencing ay isang sequencing method na binuo ni Frederick Sanger para matukoy ang tumpak na nucleotide order ng isang partikular na DNA fragment. |
| Cost Effectivity | |
| Ang NGS ay isang mas murang proseso dahil binabawasan nito ang oras, lakas ng tao at mga kemikal. | Ito ay isang magastos na proseso dahil nangangailangan ito ng oras, lakas ng tao at higit pang mga kemikal. |
| Bilis | |
| Ito ay mas mabilis dahil parehong chemical detection at signal detection ng maraming strand ay nangyayari parallel. | Nakakaubos ito ng oras dahil ang chemical detection at signal detection ay nangyayari bilang dalawang magkahiwalay na proseso at tanging sa strand lang ang makakapagbasa sa isang pagkakataon. |
| Pagiging maaasahan | |
| NGS ay maaasahan. | Hindi gaanong maaasahan ang pagkakasunud-sunod ng Sanger |
| Laki ng Halimbawa | |
| Ang NGS ay nangangailangan ng mas kaunting DNA. | Ang paraang ito ay nangangailangan ng malaking halaga ng template DNA. |
| Mga Base ng DNA sa bawat Sequenced Fragment | |
| Ang bilang ng mga base ng DNA sa bawat sequenced fragment ay mas mababa kaysa Sanger method | Ang pagbuo ng mga sequence ay mas mahaba kaysa sa NGS sequence. |
Buod – NGS vs Sanger Sequencing
Ang NGS at Sanger Sequencing ay mga nucleotide sequencing technique na malawakang ginagamit sa Molecular Biology. Ang Sanger sequencing ay isang maagang paraan ng sequencing na pinalitan ng NGS. Ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng NGS at Sanger Sequencing ay ang NGS ay isang mataas na bilis, mas tumpak at cost-effective na proseso kaysa sa Sanger sequencing. Ang parehong mga diskarte ay lumikha ng mga pangunahing outbreak sa Genetics at Biotechnology.
