Mahalagang Pagkakaiba – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Ang DNA sequencing ay napakahalaga para sa pagsusuri ng DNA dahil ang kaalaman sa tamang pag-aayos ng mga nucleotide sa isang partikular na rehiyon ng DNA ay nagpapakita ng maraming mahalagang impormasyon tungkol dito. Mayroong iba't ibang paraan ng pagkakasunud-sunod ng DNA. Ang Sanger sequencing at Pyrosequencing ay dalawang magkaibang pamamaraan ng DNA sequencing na malawakang ginagamit sa Molecular Biology. Ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng Sanger sequencing at Pyrosequencing ay ang Sanger sequencing ay gumagamit ng dideoxynucleotides upang wakasan ang synthesis ng DNA upang basahin ang nucleotide sequence habang ang pyrosequencing ay nakakakita ng pyrophosphate release sa pamamagitan ng pagsasama ng mga nucleotides at synthesizing ang complementary sequence upang mabasa ang tumpak na pagkakasunud-sunod ng sequence.
Ano ang Sanger Sequencing?
Ang Sanger sequencing ay isang unang henerasyong paraan ng DNA sequencing na binuo ni Frederick Sanger at ng kanyang mga kolehiyo noong 1977. Kilala rin ito bilang Chain Termination Sequencing o Dideoxy sequencing dahil nakabatay ito sa chain termination ng dideoxynucleotides (ddNTPs). Ang paraang ito ay malawakang ginamit nang higit sa 30 taon hanggang sa mabuo ang New Generation Sequencing (NGS). Pinagana ng Sanger sequencing technique ang pagtuklas ng tamang pagkakasunud-sunod ng nucleotide o ang attachment ng isang partikular na fragment ng DNA. Ito ay batay sa piling pagsasama ng mga ddNTP at pagwawakas ng DNA synthesis sa panahon ng in vitro DNA replication. Ang kawalan ng 3' OH na mga grupo upang ipagpatuloy ang pagbuo ng phosphodiester bond sa pagitan ng mga katabing nucleotides ay isang natatanging tampok ng mga ddNTP. Kaya, kapag ang ddNTP ay naka-attach, ang pagpapahaba ng chain ay hihinto at magtatapos mula sa puntong iyon. Mayroong apat na ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP at ddTTP - ginagamit sa Sanger sequencing. Ang mga nucleotide na ito ay humihinto sa proseso ng pagtitiklop ng DNA kapag sila ay isinama sa lumalaking strand ng DNA at nagreresulta sa iba't ibang haba ng maikling DNA. Ang capillary gel electrophoresis ay ginagamit upang ayusin ang mga maiikling DNA strand na ito ayon sa kanilang mga sukat sa isang gel tulad ng ipinapakita sa Figure 01.
Figure 1: Capillary gel electrophoresis ng synthesized short DNA
Para sa in vitro replication ng DNA, ilang mga kinakailangan ang dapat ibigay. Ang mga ito ay DNA polymerase enzyme, template DNA, oligonucleotide primers, at deoxynucleotides (dNTPs). Sa Sanger sequencing, ang DNA replication ay ginagawa sa apat na magkahiwalay na test tube kasama ang apat na uri ng ddNTPs nang hiwalay. Ang mga deoxynucleotides ay hindi ganap na pinapalitan ng kani-kanilang mga ddNTP. Ang isang halo ng partikular na dNTP (halimbawa; dATP + ddATP) ay kasama sa tubo at ginagaya. Apat na magkakahiwalay na produkto ng tubo ay pinapatakbo sa isang gel sa apat na magkakahiwalay na balon. Pagkatapos sa pamamagitan ng pagbabasa ng gel, ang pagkakasunud-sunod ay maaaring itayo tulad ng ipinapakita sa Figure 02.
Figure 02: Sanger sequencing
Ang Sanger sequencing ay isang mahalagang pamamaraan na nakakatulong sa maraming larangan ng molecular biology. Matagumpay na nakumpleto ang proyekto ng human genome sa tulong ng mga pamamaraang nakabatay sa pagkakasunud-sunod ng Sanger. Kapaki-pakinabang din ang Sanger sequencing sa target na DNA sequencing, cancer at genetic disease research, gene expression analysis, human identification, pathogen detection, microbial sequencing atbp.
May ilang disadvantages ng Sanger sequencing:
- Ang haba ng DNA na sinusunod ay hindi maaaring mas mahaba sa 1000 base pairs
- Isang strand lang ang maaaring sequenced sa isang pagkakataon.
- Ang proseso ay matagal at mahal.
Samakatuwid, ang mga bagong advanced na diskarte sa pagkakasunud-sunod ay binuo nang may oras upang malampasan ang mga problemang ito. Gayunpaman, ginagamit pa rin ang Sanger sequencing dahil sa napakatumpak nitong mga resulta hanggang sa humigit-kumulang 850 base pair length fragment.
Ano ang Pyrosequencing?
Ang Pyrosequencing ay isang nobelang DNA sequencing technique batay sa “sequencing by synthesis”. Ang pamamaraan na ito ay umaasa sa pagtuklas ng paglabas ng pyrophosphate sa pagsasama ng nucleotide. Ang proseso ay ginagamit ng apat na magkakaibang enzyme: DNA polymerse, ATP sulfurylase, luciferase at apyrase at dalawang substrate na adenosine 5’ phosphosulfate (APS) at luciferin.
Nagsisimula ang proseso sa pag-binding ng primer sa single-stranded DNA template at sinisimulan ng DNA polymerase ang pagsasama ng mga nucleotide na pantulong dito. Kapag nagsama-sama ang mga nucleotide (nucleic acid polymerization), naglalabas ito ng pyrophosphate (dalawang grupo ng pospeyt na pinagsama-sama) na mga grupo at enerhiya. Ang bawat pagdaragdag ng nucleotide ay naglalabas ng equimolar na dami ng pyrophosphate. Ang Pyrophosphate ay nagko-convert sa ATP sa pamamagitan ng ATP sulfurylase sa pagkakaroon ng substrate APS. Ang nabuong ATP ay nagtutulak sa luciferase-mediated na conversion ng luciferin sa oxyluciferin, na gumagawa ng nakikitang liwanag sa mga halagang proporsyonal sa dami ng mga ATP. Nakikita ang liwanag ng isang photon detection device o ng photomultiplier at lumilikha ng pyrogram. Ang Apyrase ay nagpapababa ng ATP at mga di-incorporated na dNTP sa pinaghalong reaksyon. Ang pagdaragdag ng dNTP ay ginagawa nang minsanan. Dahil ang pagdaragdag ng nucleotide ay kilala ayon sa pagsasama at pagtuklas ng liwanag, ang pagkakasunud-sunod ng template ay maaaring matukoy. Ang pyrogram ay ginagamit para sa pagbuo ng nucleotide sequence ng sample na DNA gaya ng ipinapakita sa Figure 03.
Ang Pyrosequencing ay napakahalaga sa solong nucleotide polymorphism analysis at sequencing ng maikling stretches ng DNA. Ang mataas na katumpakan, flexibility, kadalian ng automation at parallel processing ay ang mga bentahe ng pyrosequencing kaysa sa Sanger sequencing techniques.
Figure 03: Pyrosequencing
Ano ang pagkakaiba ng Sanger Sequencing at Pyrosequencing?
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
|
| Ang Sanger sequencing ay isang paraan ng DNA sequencing batay sa selective incorporation ng mga ddNTP sa pamamagitan ng DNA polymerase at chain termination. | Ang Pyrosequencing ay isang paraan ng pagkakasunud-sunod ng DNA batay sa pagtuklas ng paglabas ng pyrophosphate sa pagsasama ng nucleotide. |
| Paggamit ng ddNTP | |
| ddNTPs ay ginagamit upang wakasan ang DNA replication | ddNTPs ay hindi ginagamit. |
| Mga kasangkot na enzyme | |
| DNA polymerase ang ginagamit. | Apat na enzyme ang ginagamit: DNA polymerase, ATP sulfurylase, Luciferase at Apyrase. |
| Mga Nagamit na Substrate | |
| APS at Luciferin ay hindi ginagamit. | Adenosine 5’ phosphosulfate (APS) at luciferin ang ginagamit. |
| Maximum Temperature | |
| Ito ay isang mabagal na proseso. | Ito ay isang mabilis na proseso. |
Buod – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Ang Sanger sequencing at Pyrosequencing ay dalawang paraan ng DNA sequencing na ginagamit sa molecular biology. Binubuo ng Sanger sequencing ang pagkakasunud-sunod ng mga nucleotide sa pamamagitan ng pagwawakas sa pagpapahaba ng kadena habang ang pyrosequencing ay bubuo ng tumpak na pagkakasunud-sunod ng mga nucleotides sa pagkakasunud-sunod sa pamamagitan ng pagsasama ng mga nucleotides at pag-detect ng paglabas ng mga pyrophosphate. Samakatuwid, ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng Sanger sequencing at Pyrosequencing ay ang Sanger sequencing ay gumagana sa sequencing sa pamamagitan ng chain termination habang ang pyrosequencing ay gumagana sa sequencing by synthesis.
