Mahalagang Pagkakaiba – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Ang Nucleotides ay ang mga pangunahing structural unit at building blocks ng DNA. Ang molekula ng DNA ay binubuo ng isang polynucleotide chain. Mayroong apat na magkakaibang nucleotide na matatagpuan sa DNA. Ang mga nucleotide na ito ay binubuo ng apat na magkakaibang nitrogenous base na pinangalanang A (adenine), G (guanine), C (cytosine), T (thymine). Ang pagkakasunud-sunod ng mga nucleotide sa molekula ng DNA ay may malaking kahalagahan dahil ito ay nag-encode ng isang mahalagang genetic na impormasyon para sa paglaki at pag-unlad ng mga organismo. Ang DNA sequencing ay tumutukoy sa proseso na tumutukoy sa tumpak na nucleotide sequence ng DNA. Mayroong iba't ibang paraan ng pagkakasunud-sunod ng DNA. Ang Maxam Gilbert sequencing at Sanger DNA sequencing ay dalawang paraan ng DNA sequencing na nabibilang sa first generation sequencing. Tinutukoy ng Maxam Gilbert sequencing procedure ang base sequence sa pamamagitan ng chemically cleaving sa 5' end na may label na DNA fragment na mas gusto sa bawat isa sa apat na nucleotides at gel electrophoresis. Tinutukoy ng Sanger sequencing procedure ang nucleotide sequence sa pamamagitan ng synthesizing single-stranded DNA gamit ang DNA polymerase at dideoxynucleotides at gel electrophoresis. Ito ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng Maxam Gilbert at Sanger Sequencing.
Ano ang Maxam Gilbert Sequencing?
Ang Maxam Gilbert sequencing, na kilala rin bilang chemical sequencing method, ay isang pamamaraan na binuo upang matukoy ang pagkakasunud-sunod ng mga nucleotide sa DNA. Ang pamamaraang ito ay ipinakilala nina W alter Gilbert at Alan Maxam noong 1976 at naging tanyag dahil maaari itong direktang gawin gamit ang purified DNA. Ang Maxam Gilbert method ay kabilang sa unang henerasyon ng DNA sequencing, at ito ang unang sequencing method na malawakang ginagamit ng mga scientist.
Ang pangunahing prinsipyo ng pamamaraang ito ay nakasalalay sa paghihigpit ng mga end-label na DNA fragment sa mga partikular na base sa pamamagitan ng base-specific na mga kemikal at kundisyon at paghihiwalay ng mga may label na fragment sa pamamagitan ng electrophoresis tulad ng ipinapakita sa figure 01. Ang mga fragment ay pinaghihiwalay ayon sa sa kanilang mga sukat sa gel. Dahil may label ang mga fragment, madaling mahihinuha ang sequence ng DNA molecule.
Ang Maxam gilbert method ay gumagamit ng mga base na partikular na kemikal upang masira ang DNA sa mga partikular na base. Dalawang karaniwang kemikal na pinangalanang dimethyl sulphate at hydrazine chemicals ang ginagamit upang piliing atakehin ang mga purine at pyrimidines, ayon sa pagkakabanggit.
Maxam Gilbert sequencing method ay ginaganap sa pamamagitan ng ilang hakbang gaya ng sumusunod.
- Purification ng DNA sequence gamit ang restriction endonucleases
- Pag-label ng mga dulo ng mga fragment ng DNA sa pamamagitan ng pagdaragdag ng mga radioactive phosphate
- Paglilinis ng mga may label na mga fragment mula sa mga hindi may label na mga fragment sa pamamagitan ng gel electrophoresis
- Paghihiwalay ng end-label na DNA sa apat na tubo at pagtrato gamit ang mga base na partikular na kemikal nang hiwalay
- Electrophoresis ng mga nilalaman ng bawat tubo sa magkahiwalay na linya sa isang gel at paghihiwalay ng fragment ayon sa haba ng mga ito.
- Detection ng mga fragment sa pamamagitan ng autoradiograph.
Figure 01: Maxam Gilbert Sequencing
Ano ang Sanger Sequencing?
Ang Sanger Sequencing ay isang paraan ng sequencing na binuo ni Frederick Sanger at ng kanyang mga kasamahan noong 1977 upang matukoy ang base sequence ng isang partikular na fragment ng DNA. Ito ay kilala rin bilang chain termination sequencing o Dideoxy sequencing method. Gumagana ang pamamaraang ito sa prinsipyo ng selective incorporation ng chain terminating dideoxynucleotides (ddNTPs) tulad ng ddGTP, ddCTP, ddATP at ddTTP ng DNA polymerase sa panahon ng synthesis ng single stranded DNA upang wakasan ang strand formation. Ang dideoxynucleotides ay kulang sa 3' OH na mga grupo para sa pagbuo ng mga phosphodiester bond na may katabing nucleotide. Kaya naman, humihinto ang pagbuo ng strand kapag naisama na ang isang ddNTP sa bagong nabuong strand sa panahon ng sanger sequencing.
Sa paraang ito, apat na magkahiwalay na DNA synthesis reactions (PCR) ang ginagawa sa apat na magkahiwalay na tubo na may isang uri ng ddNTP. Ang iba pang mga kinakailangan ay ibinibigay din para sa mga tubo para sa PCR kabilang ang mga panimulang aklat, dNTP, Taq polymerase, mga partikular na kondisyon, atbp. Apat na magkakahiwalay na reaksyon ang ginagawa sa apat na tubo na may apat na pinaghalong. Pagkatapos ng mga reaksyon ng PCR, ang nagreresultang mga fragment ng DNA ay na-denatured ng init at pinaghihiwalay ng gel electrophoresis. Pagkatapos ay makikita ang mga fragment sa pamamagitan ng paggamit ng alinman sa may label na (radioactive o fluorescent) na primer o dNTP gaya ng ipinapakita sa figure 02.
Figure 02: Sanger Sequencing
Ano ang pagkakaiba ng Maxam Gilbert at Sanger Sequencing?
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Maxam Gilbert sequencing ay ang unang technique na binuo para sa DNA sequencing. | Sanger sequencing method ay ipinakilala pagkatapos ng Maxam Gilbert sequencing method. |
| Paggamit | |
| Bihirang gamitin ang paraang ito. | Ang sanger sequencing ay karaniwang ginagamit para sa sequencing. |
| Paggamit ng Mapanganib na Kemikal | |
| Gumagamit ito ng mga mapanganib na kemikal. | Ang paggamit ng mga mapanganib na kemikal ay limitado kumpara sa Maxam Gilbert method. |
| Labeling for Detection | |
| Gumagamit ang paraang ito ng radioactive P32 para sa paglalagay ng label sa mga dulo ng mga fragment ng DNA. | Ang Sanger sequencing ay gumagamit ng radioactive o fluorescently na may label na mga ddNTP. |
Buod – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Ang Maxam Gilbert at Sanger sequencing ay dalawang uri ng DNA sequencing technique na nasa ilalim ng unang henerasyong DNA sequencing. Ang Maxam Gilbert sequencing ay ang unang paraan na ipinakilala para sa DNA sequencing noong 1976, at ito ay ginagawa sa pamamagitan ng pagsira sa dulo na may label na DNA fragment ng mga base-specific na kemikal. Samakatuwid, ito ay kilala bilang chemical sequencing. Ang pamamaraan ng pagkakasunud-sunod ng Sanger ay ipinakilala noong 1977, at batay sa mga reaksyon ng pagwawakas ng chain na hinimok ng ddNTP. Ang Sanger sequencing method ay popular kaysa Maxam Gilbert method dahil sa ilang disadvantages ng Maxam Gilbert method gaya ng sobrang pagkonsumo ng oras, paggamit ng mga mapanganib na kemikal, atbp. Ito ang pagkakaiba sa pagitan ng Maxam Gilbert at Sanger sequencing.
