Mahalagang Pagkakaiba – Gene Cloning vs PCR
Ang synthesis ng maraming kopya ng DNA mula sa isang partikular na fragment ng DNA ay tinatawag na DNA amplification. Mayroong dalawang pangunahing proseso ng amplification ng DNA na ang gene cloning at PCR. Ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng gene cloning at PCR ay, ang gene cloning ay gumagawa ng maraming kopya ng isang partikular na gene sa vivo sa pamamagitan ng pagbuo ng recombinant DNA at paglaki sa loob ng host bacterium habang ang PCR ay gumagawa ng milyun-milyong kopya ng isang partikular na fragment ng DNA sa vitro na sumasailalim sa paulit-ulit na mga cycle ng denaturation at synthesis.
Ano ang Gene Cloning?
Ang Gene cloning ay isang pamamaraan na ginagamit upang mahanap at i-multiply ang isang partikular na gene mula sa kinuhang genomic DNA ng isang organismo sa pamamagitan ng pagbuo ng recombinant DNA. Ang genomic DNA ay naglalaman ng libu-libong iba't ibang mga gene na naka-encode para sa mga protina. Kapag kinuha ang DNA, kasama rito ang lahat ng posibleng gene na maaari nitong dalhin. Pinagana ng pamamaraan ng pag-clone ng gene ang pagtuklas ng isang partikular na gene mula sa kabuuang DNA. Samakatuwid ang gene cloning ay nagsisilbing mahalagang kasangkapan sa molecular biology.
Ang paggawa ng genomic library ng isang organismo ay mahalaga sa gene cloning kung walang clue tungkol sa lokasyon ng nauugnay na gene sa DNA. Ginagawa ang isang genomic library gamit ang mga sumusunod na hakbang.
Hakbang 1: Pagkuha ng kabuuang DNA mula sa isang organismo na naglalaman ng gustong gene.
Hakbang 2: Limitahan ang pagtunaw ng nakuhang DNA upang makagawa ng maliliit na mapapamahalaang fragment. Ang hakbang na ito ay pinadali ng restriction endonucleases.
Hakbang 3: Pagpili ng angkop na vector at pagbubukas ng vector DNA gamit ang parehong restriction endonucleases. Ang mga bacterial plasmid ay karaniwang ginagamit bilang mga vector upang magdala ng dayuhang DNA. Ang mga plasmid ay maliliit na bilog ng DNA na matatagpuan sa loob ng bacteria.
Hakbang 4: Pagsasama-sama ng vector DNA at fragmented DNA para makagawa ng recombinant DNA molecule. Ang hakbang na ito ay pinamamahalaan ng DNA ligase.
Hakbang 5: Paglilipat ng mga recombinant DNA molecule sa host bacteria. Ang hakbang na ito ay kilala bilang pagbabago, at ginagawa gamit ang heat shock.
Hakbang 5: Pag-screen ng mga nabagong bacterial cell sa isang culture medium. Ang isang halo-halong populasyon ng transformed at nontransformed host cells ay nakuha sa pagtatapos ng proseso ng pagbabago. Bilang gene ng interes kasama lamang sa transformed host cell. Samakatuwid, kinakailangan na pumili ng mga nabagong selula. Ang pagpili ay ginawa gamit ang selective media na naglalaman ng antibiotics. Tanging ang mga nabagong cell lang ang lumalaki sa screening medium na ito na nagpapagana sa pagpili.
Hakbang 6: Paglaki ng bacteria para makagawa ng gene library. Sa hakbang na ito, ang mga binagong host cell ay ipinakilala sa sariwang kulturang media na nagbibigay ng pinakamabuting kalagayan na kinakailangan sa paglago. Ang kabuuang mga kolonya sa mga culture plate ay kumakatawan sa genomic library ng organismong iyon.
Hakbang 7: Ang recombinant DNA molecule na naglalaman ng gene ng interes ay dapat ma-screen mula sa libu-libong mga cloned fragment ng recombinant DNA. Magagawa ito sa pamamagitan ng paggamit ng mga probe na nagmamarka sa partikular na gene o sa partikular na resulta ng protina mula sa gene na iyon.
Kapag natukoy ang interesadong gene na naglalaman ng bacterial colony mula sa kabuuang mga kolonya, posibleng gumawa ng milyun-milyong kopya ng recombinant plasmid na naglalaman ng gene.
Ginagamit ang gene cloning sa pagtatatag ng mga gene libraries, paggawa ng espesyal na protina, bitamina, antibiotic, hormone, sequencing at pagma-map ng mga genome ng mga organismo, paggawa ng maraming kopya ng mga indibidwal na DNA sa forensics atbp.
Figure_1: Gene Cloning
Ano ang PCR?
Ang Polymerase Chain Reaction (PCR) ay isang pamamaraan na bumubuo ng malaking bilang ng mga kopya ng isang partikular na fragment ng DNA. Ang exponential amplification ng isang tiyak na sequence ng DNA ay nakuha ng PCR sa ilalim ng in vitro na mga kondisyon. Ang diskarteng ito ay isang napakalakas na tool sa Molecular Biology dahil maaari nitong i-multiply ang isang maliit na sample ng DNA sa isang magagamit na halaga. Ang PCR ay ipinakilala ni Kary Mullis noong 1983 at ang imbensyong ito na nanalo ng premyo ay lumikha ng malaking pag-unlad sa Molecular Biology.
Ang
PCR technique ay sumusunod sa paulit-ulit na PCR reaction gaya ng ipinapakita sa Figure 02. Ang isang PCR reaction ay binubuo ng tatlong pangunahing hakbang na nagaganap sa tatlong magkakaibang temperatura; denaturing ng double stranded sa DNA sa 94 0C, annealing of primers sa 68 0C at strand elongation sa 72 0 C. Samakatuwid, kapag isinagawa ang PCR, ang pagbabagu-bago ng temperatura ay dapat na lubos na mapanatili para sa wastong pagtitiklop. Ginagawa ang PCR sa isang PCR machine sa loob ng PCR tubes. Ang mga PCR tube ay puno ng tamang PCR mixtures na naglalaman ng template DNA, Taq polymerase, primers, dNTPs at buffer. Ang pag-denaturasyon ng double stranded sample DNA sa single stranded DNA ay ginagawa sa pamamagitan ng pagsira ng hydrogen bonds sa pagitan ng mga complementary base sa 94 – 98 0C. Pagkatapos ay ilantad ang mga solong hibla ng template DNA para sa mga panimulang aklat. Ang isang pares ng mga panimulang aklat (pasulong at pabalik) ay dapat na ibigay, at dapat silang maging thermostable upang tiisin ang mataas na temperatura. Ang mga panimulang aklat ay mga solong stranded na maiikling pagkakasunud-sunod ng DNA na komplemento sa mga dulo ng target na fragment ng DNA. Ang mga sintetikong primer ay ginagamit sa PCR. Ang mga panimulang aklat ay nagbubuklod sa mga pantulong na base ng sample na DNA at sinisimulan ang synthesis ng isang bagong strand. Ang hakbang na ito ay na-catalyzed ng isang enzyme na tinatawag na Taq polymerase; isang thermostable DNA polymerase enzyme na nakahiwalay sa Thermus auqaticus. Kapag ang mga panimulang aklat at nucleotides (mga bloke ng gusali) ay magagamit, ang Taq polymerase ay bumubuo ng bagong strand ng DNA na pandagdag sa template ng DNA. Sa pagtatapos ng PCR program, ang amplified DNA fragment ay sinusunod gamit ang gel electrophoresis. Kung kinakailangan ang karagdagang pagsusuri, ang produkto ng PCR ay dinadalisay mula sa gel.
Ang PCR ay lubhang kapaki-pakinabang para sa pag-diagnose at pagsubaybay sa mga genetic at nakuhang sakit, pagkilala sa mga kriminal (sa larangan ng forensics), pag-aaral ng istraktura at paggana ng isang target na segment ng DNA, pagkakasunud-sunod at pagmamapa ng mga genome ng mga organismo, atbp. Ang PCR ay naging isang nakagawiang pamamaraan sa laboratoryo sa mga laboratoryo ng pananaliksik sa medikal at molekular na biology sa mga siyentipiko dahil mayroon itong malawak na iba't ibang mga aplikasyon.
Figure_2: Polymerase Chain Reaction
Ano ang pagkakaiba ng Gene Cloning at PCR?
Gene Cloning vs PCR |
|
| Ang gene cloning ay ang proseso ng paggawa ng maraming kopya ng isang partikular na gene sa vivo sa pamamagitan ng recombinant na DNA at nagiging host bacterium. | Ang PCR technique ay gumagawa ng maraming kopya ng isang partikular na DNA sequence in vitro sa pamamagitan ng paulit-ulit na cycle ng PCR reactions. |
| Kailangan sa Pagbuo ng Recombinant DNA | |
| Ginagawa ang recombinant DNA upang mahanap ang gene. | Hindi ginawa ang recombinant na DNA. |
| Need of Labour | |
| Matrabaho ang prosesong ito. | Hindi kailangan ang masinsinang paggawa. |
| In vivo o In vitro process | |
| Ang pagbuo ng recombinant DNA ay in vitro at ang amplification ng DNA ay nasa vivo. | Ang amplification ng DNA ay ganap na nangyayari sa vitro. |
Buod – Gene Cloning vs PCR
Ang Gene cloning at PCR ay dalawang paraan na ginagamit para sa DNA amplification. Ang PCR ay isang in vitro na proseso na gumagawa ng maraming kopya ng DNA ng isang partikular na fragment ng DNA nang hindi gumagamit ng recombinant na DNA at isang host organism. Ang pag-clone ng gene ay pangunahing isang proseso sa vivo na nagreresulta sa maraming kopya ng isang interesadong gene sa loob ng host organism sa pamamagitan ng pagbuo ng recombinant na DNA. Ito ang pagkakaiba sa pagitan ng Gene cloning at PCR.
