Mahalagang Pagkakaiba – Microarray vs RNA Sequencing
Kinakatawan ng Transcriptome ang buong content ng RNA na nasa isang cell kabilang ang mRNA, rRNA, tRNA, degraded RNA, at, nondegraded RNA. Ang pag-profile ng transcriptome ay isang mahalagang proseso upang maunawaan ang mga insight sa cell. Mayroong ilang mga advanced na pamamaraan para sa transcriptome profiling. Ang Microarray at RNA sequencing ay dalawang uri ng mga teknolohiya na binuo upang pag-aralan ang transcriptome. Ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng microarray at RNA sequencing ay ang microarray ay batay sa hybridization potential ng predesigned labeled probes na may target na cDNA sequences habang ang RNA sequencing ay batay sa direktang sequencing ng cDNA strands sa pamamagitan ng advanced sequencing techniques tulad ng NGS. Ginagawa ang Microarray nang may paunang kaalaman tungkol sa mga sequence at ang RNA sequencing ay ginagawa nang walang paunang kaalaman tungkol sa mga sequence.
Ano ang Microarray?
Ang Microarray ay isang matatag, maaasahan at mataas na throughput na paraan na ginagamit para sa transcriptome profiling ng mga siyentipiko. Ito ang pinakasikat na diskarte para sa transcript analysis. Ito ay isang murang paraan, na nakadepende sa hybridization probe.
Nagsisimula ang pamamaraan sa pagkuha ng mRNA mula sa sample at pagbuo ng cDNA library mula sa kabuuang RNA. Pagkatapos ay hinaluan ito ng fluorescently na may label na predesigned probes sa isang solidong ibabaw (spot matrix). Ang mga komplementaryong sequence ay nagha-hybrid sa mga may label na probe sa microarray. Pagkatapos ang microarray ay hugasan at sinasala, at ang imahe ay binibilang. Dapat suriin ang mga nakalap na data upang makuha ang mga kaugnay na profile ng expression.
Ang intensity ng microarray probes ay ipinapalagay na proporsyonal sa dami ng mga transcript sa sample. Gayunpaman, ang katumpakan ng pamamaraan ay nakasalalay sa mga dinisenyo na probes, naunang kaalaman sa pagkakasunud-sunod at ang pagkakaugnay ng mga probes para sa hybridization. Samakatuwid ang teknolohiya ng microarray ay may mga limitasyon. Hindi maisagawa ang microarray technique na may mababang transcript ng abundance. Nabigo itong ibahin ang mga isoform at tukuyin ang mga genetic na variant. Dahil ang pamamaraang ito ay nakasalalay sa hybridization ng mga probe, ang ilang problemang nauugnay sa hybridization gaya ng cross-hybridization, nonspecific hybridization atbp. ay nangyayari sa microarray technique.
Figure 01: Microarray
Ano ang RNA Sequencing?
Ang RNA shotgun sequencing (RNA seq) ay isang kamakailang binuong buong transcriptome sequencing technique. Ito ay isang mabilis at mataas na throughput na paraan ng transcriptome profiling. Direktang binibilang nito ang pagpapahayag ng mga gene at nagreresulta sa malalim na pagsisiyasat ng transcriptome. Ang RNA seq ay hindi nakadepende sa mga predesigned na probe o dating kaalaman sa mga sequence. Samakatuwid, ang RNA seq method ay may mataas na sensitivity at kakayahan sa pag-detect ng mga novel genes at genetic variants.
Ang RNA sequencing method ay ginagawa sa pamamagitan ng ilang hakbang. Ang kabuuang RNA ng cell ay dapat na ihiwalay at pira-piraso. Pagkatapos, gamit ang reverse transcriptase, isang cDNA library ay dapat na ihanda. Ang bawat cDNA strand ay dapat na nakagapos ng mga adaptor. Pagkatapos ang mga ligated na fragment ay dapat na palakasin at dalisayin. Sa wakas, gamit ang isang paraan ng NGS, dapat isagawa ang pagkakasunud-sunod ng cDNA.
Figure 02: RNA Sequencing
Ano ang pagkakaiba ng Microarray at RNA sequencing?
Microarray vs RNA Sequencing |
|
| Ang Microarray ay isang matatag, maaasahan, mataas na throughput na paraan. | Ang RNA sequencing ay isang tumpak at high-throughput na paraan. |
| Gastos | |
| Ito ay isang murang paraan. | Ito ay isang mamahaling paraan. |
| Pagsusuri ng Malaking Bilang ng Mga Sample | |
| Pinapadali nito ang pagsusuri ng malaking bilang ng mga sample nang sabay-sabay. | Pinapadali nito ang pagsusuri ng malaking bilang ng mga sample. |
| Pagsusuri ng Data | |
| Ang pagsusuri ng data ay kumplikado. | Higit pang data ang nabuo sa paraang ito; kaya, mas kumplikado ang proseso. |
| Dating Kaalaman sa Mga Pagkakasunud-sunod | |
| Ang paraang ito ay nakabatay sa hybridization probe, kaya kinakailangan ang paunang kaalaman sa mga sequence. | Hindi nakadepende ang paraang ito sa naunang kaalaman sa sequence. |
| Mga Structural Variations at Novel Genes | |
| Hindi matukoy ng paraang ito ang mga pagkakaiba-iba sa istruktura at mga nobelang gene. | Maaaring makita ng paraang ito ang mga pagkakaiba-iba sa istruktura gaya ng gene fusing, alternatibong splicing, at novel genes. |
| Sensitivity | |
| Hindi nito matukoy ang mga pagkakaiba sa pagpapahayag ng mga isoform, kaya limitado ang sensitivity nito. | Ito ay may mataas na sensitivity. |
| Kinalabasan | |
| Maaari lamang itong magresulta sa mga kaugnay na antas ng expression. Hindi ito nagbibigay ng ganap na dami ng expression ng gene. | Nagbibigay ito ng ganap at kaugnay na mga antas ng pagpapahayag. |
| Reanalysis ng Data | |
| Kailangan itong muling patakbuhin upang muling masuri. | Maaaring muling suriin ang data ng sequencing. |
| Kailangan para sa Partikular na Tauhan at Imprastraktura | |
| Hindi kailangan ang partikular na imprastraktura at tauhan para sa microarray. | Mga partikular na imprastraktura at tauhan na kailangan ng RNA sequencing. |
| Mga Isyu sa Teknikal | |
| May mga teknikal na isyu ang Microarray technique gaya ng cross-hybridization, nonspecific hybridization, limitadong rate ng pagtuklas ng mga indibidwal na probe, atbp. | Iniiwasan ng RNA seq technique ang mga teknikal na isyu gaya ng cross-hybridization, nonspecific hybridization, limitadong rate ng pagtuklas ng mga indibidwal na probe, atbp. |
| Mga bias | |
| Ito ay isang bias na paraan dahil nakadepende ito sa hybridization. | Mababa ang bias kumpara sa microarray. |
Buod – Microarray vs RNA Sequencing
Ang Microarray at RNA sequencing method ay mga high throughput platform na binuo para sa transcriptome profiling. Ang parehong mga pamamaraan ay gumagawa ng mga resulta na lubos na nauugnay sa mga profile ng expression ng gene. Gayunpaman, ang pagkakasunud-sunod ng RNA ay may mga pakinabang sa microarray para sa pagsusuri ng expression ng gene. Ang pagkakasunud-sunod ng RNA ay isang mas sensitibong pamamaraan para sa pagtuklas ng mga mababang transcript ng kasaganaan kaysa sa microarray. Ang RNA sequencing ay nagbibigay-daan din sa pagkita ng kaibahan sa pagitan ng mga isoform at pagkakakilanlan ng mga variant ng gene. Gayunpaman, ang microarray ay ang karaniwang pagpipilian ng karamihan sa mga mananaliksik dahil ang RNA sequencing ay isang bago at mamahaling pamamaraan na may mga hamon sa pag-iimbak ng data at kumplikadong pagsusuri ng data.
