Mahalagang Pagkakaiba – RT PCR vs QPCR
Ang Polymerase Chain Reaction ay isang pamamaraan na ginagamit upang palakihin ang isang partikular na rehiyon ng DNA sa vitro. Dahil sa pag-imbento ng pamamaraang ito ni Kary Mullis noong 1983, ang mga siyentipiko ay nakakagawa ng libo hanggang milyon-milyong kopya ng mga partikular na fragment ng DNA para sa mga layunin ng pananaliksik. Sa kasalukuyan ito ay naging pangkaraniwan at nakagawiang ginagawang pamamaraan sa mga laboratoryo ng klinikal at pananaliksik para sa malawak na iba't ibang mga aplikasyon. Mayroong mga pagkakaiba-iba ng tradisyonal na pamamaraan ng PCR tulad ng RT PCR, nested PCR, multiplex PCR, Q PCR, RT – QPCR, atbp. Ang RT PCR at Q PCR ay dalawang mahalagang variation ng PCR. Ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng RT PCR at Q PCR ay ang RT PCR ay ginagamit upang makita ang expression ng gene sa pamamagitan ng paglikha ng mga pantulong na DNA (cDNA) transcript mula sa RNA habang ang Q PCR ay ginagamit upang sukatin ang dami ng mga produkto ng PCR sa real time gamit ang mga fluorescent dyes.
Ano ang RT PCR?
Ang Reverse transcription polymerase chain reaction (RT PCR) ay isang variant ng PCR na ginagamit upang makita ang RNA expression. Ito ay isang napakahalagang paraan para sa pag-detect ng mRNA expression sa mga tisyu. Ang RT PCR ay ginagamit kapag ang panimulang materyal ng sample ay RNA. Sa RT PCR, ang template mRNA ay unang na-convert sa pantulong na DNA. Ang hakbang na ito ay na-catalyzed ng enzyme reverse transcriptase at ang proseso ay kilala bilang reverse transcription. Pangalawa, ginagamit ang tradisyonal na PCR para sa bagong synthesize na cDNA para sa amplification.
Ang RT PCR ay isang napakasensitibong pamamaraan na nangangailangan ng medyo maliit na dami ng sample ng RNA. Karaniwang ginagamit ang RT PCR sa diagnosis at quantification ng RNA species, lalo na ang mga RNA virus gaya ng human immunodeficiency virus at hepatitis C virus.
Figure 01: RT PCR Technique
Ano ang QPCR?
Ang Quantitative PCR (QPCR) ay isang variant ng PCR na ginagamit upang sukatin ang dami ng mga produkto ng PCR. Tinutukoy din ito bilang real-time na polymerase chain reaction dahil sinusukat nito ang amplification ng real time gamit ang real time PCR machine. Ito ay isang angkop na paraan para sa pagtukoy ng dami ng isang target na sequence o gene na naroroon sa isang sample. Ang kawili-wiling tampok ng QPCR ay pinagsasama nito ang parehong amplification at totoong quantification sa isang solong hakbang. Samakatuwid, ang pangangailangan para sa gel electrophoresis sa pagtuklas ay maaaring alisin sa pamamagitan ng QPCR technique. Gumagamit ang QPCR ng mga fluorescent dyes upang lagyan ng label ang mga produkto ng PCR sa panahon ng mga reaksyon ng PCR na kalaunan ay humahantong sa direktang dami. Kapag naipon ang mga produkto ng PCR, naipon din ang mga fluorescent signal at ito ay susukatin ng real time machine. Ang QPCR ay maaaring isama sa RT PCR. Ito ay kilala bilang RT – QPCR o QRT – PCR at itinuturing na pinakamakapangyarihan, sensitibo at quantitative na paraan para sa pagtukoy ng mga antas ng RNA sa mga cell o tissue.
Ang SYBR Green at Taqman ay dalawang paraan na ginagamit upang makita o mapanood ang proseso ng amplification ng real time PCR. Ang pamamaraan ng SYBR Green ay isinasagawa gamit ang isang fluorescent dye na tinatawag na SYBR green at nakikita ang amplification sa pamamagitan ng pagbubuklod ng dye upang makagawa ng double stranded DNA. Isinasagawa ang Taqman gamit ang dual-labeled probes at nakita ang amplification sa pamamagitan ng degradation ng probe sa pamamagitan ng Taq polymerase at mga paglabas ng fluorophore tulad ng ipinapakita sa figure 02. Ang parehong pamamaraan ay sinusubaybayan ang pag-usad ng proseso ng amplification at iniulat ang dami ng produkto sa totoong oras..
Real time PCR ay may malawak na iba't ibang mga application tulad ng gene expression quantification, microRNA at noncoding RNA analysis, SNP genotyping, detection ng mga variant ng copy number, detection ng mga bihirang mutasyon, detection ng genetically modified organisms, detection of infectious agents, atbp.
Figure 02: Quantitative PCR technique
Ano ang pagkakaiba ng RT PCR at QPCR?
RT PCR vs QPCR |
|
| Ang RT PCR ay isang pamamaraan na ginagamit upang makita ang expression ng gene sa pamamagitan ng amplification. | Ang QPCR ay isang pamamaraan na nagpapalaki ng DNA at binibilang ang mga produkto ng PCR sa real time. |
| Paglahok ng Reverse Transcriptase Enzyme | |
| Enzyme reverse transcriptase ay ginagamit para sa RT PCR. | Hindi ginagamit ang Enzyme reverse transcriptase para sa QPCR. |
| Paggamit ng Fluorescently Labeled Molecules | |
| Ang mga tina o probe na may fluorescently na may label ay hindi ginagamit para sa RT PCR. | Fluorescently labeled dyes o probe ay ginagamit para sa QPCR. |
| Quantification ng PCR product | |
| Maliban kung isinama sa QPCR, hindi binibilang ng RT PCR ang produkto ng PCR. | QPCR sa dami ng sinusukat ang produkto ng PCR. |
| Pasimulang Materyal | |
| Ang panimulang materyal ay mRNA. | Ang panimulang materyal ay DNA. |
| Synthesis ng cDNA | |
| Ang komplementaryong DNA ay ginawa sa panahon ng RT PCR. | Ang komplementaryong DNA ay hindi ginawa sa panahon ng QPCR. |
Buod – RT PCR vs QPCR
Ang RT PCR at QPCR ay dalawang bersyon ng tradisyonal na PCR. Ang pamamaraan ng RT PCR ay ginagawa para sa mga sample ng mRNA at ito ay hinihimok ng reverse transcription at produksyon ng cDNA. Ginagamit ang QPCR upang mabilang ang mga produkto ng PCR sa panahon ng real time na mga thermal cycle ng PCR gamit ang mga fluorescent dyes o may label na probe. Sa QPCR, ang dami ng produkto ng PCR ay kinakatawan ng mga ibinubuga na fluorescent signal ng sample. Ang RT PCR ay sikat na ginagamit bilang isang proseso ng amplification habang ang QPCR ay karaniwang ginagamit bilang isang proseso ng quantification. Ito ang pagkakaiba sa pagitan ng RT PCR at QPCR.
