Ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng conventional nested at real-time PCR assays ay ang conventional PCR ay isang technique na binuo para palakihin ang mga partikular na sequence ng DNA at ang nested PCR ay isang modification ng conventional PCR na binubuo ng dalawang sequential amplification reactions, habang ang totoo Ang -time na PCR ay isang variant ng conventional PCR na nagagawang ma-quantify ang amplified na produkto.
Ang PCR ay isang pangkaraniwang pamamaraang pang-agham na malawakang ginagamit sa pagsasaliksik at medisina upang matukoy ang DNA. Ang mga pagsusuri sa PCR ay ginagamit upang makita ang mga antigen sa pamamagitan ng pag-detect ng kanilang DNA o RNA. Sa pangkalahatan, ang viral RNA ay naroroon sa katawan bago makakita ng mga antibodies o magpakita ng mga sintomas ng sakit. Maaaring malaman ng PCR test kung ang isang tao ay may virus nang maaga. Sa kasalukuyan, ang PCR ang karaniwang pagsusuri para sa pagtuklas ng sakit na COVID-19. May iba't ibang uri ng mga diskarte sa PCR gaya ng real-time PCR, nested PCR, multiplex PCR, hot start PCR at long-range PCR, atbp.
Ano ang Conventional PCR Assays?
Ang Conventional PCR assay ay isang in vitro DNA amplification technique na karaniwang ginagawa sa molecular biological laboratories. Ang pamamaraang ito ay nagbigay-daan sa paggawa ng libu-libo hanggang milyon-milyong kopya ng isang partikular na fragment ng DNA. Ipinakilala ni Kary Mullis ang pamamaraang ito noong 1980. Ang pamamaraang ito ay nangangailangan ng fragment ng DNA na kilala bilang template upang makagawa ng maraming kopya nito. Gumagana ang Taq polymerase bilang DNA polymerase enzyme at pinapagana ang synthesis ng mga bagong strand ng template sequence.
Ang mga primer sa PCR mixture ay gagana bilang mga panimulang punto para sa mga extension ng fragment. Ang lahat ng mga sangkap na kinakailangan upang makagawa ng mga kopya ng DNA ay kasama sa pinaghalong PCR. Ang PCR reaction ay pinapatakbo sa isang PCR machine, at dapat itong pakainin ng tamang PCR mixture at tamang PCR program. Kung tama ang reaction mixture at ang program, gagawa ito ng kinakailangang bilang ng mga kopya ng isang partikular na seksyon ng DNA mula sa napakaliit na halaga ng DNA.
Figure 01: Conventional PCR Assay
May tatlong pangunahing hakbang na kasangkot sa isang PCR reaction: denaturation, primer annealing, at strand extension. Ang tatlong hakbang na ito ay nangyayari sa tatlong magkakaibang temperatura. Pinapanatili ng PCR buffer ang pinakamainam na kondisyon para sa pagkilos ng Taq polymerase. Ang tatlong yugto ng reaksyon ng PCR ay paulit-ulit upang makagawa ng kinakailangang halaga ng produkto ng PCR. Sa bawat reaksyon ng PCR, doble ang bilang ng mga kopya ng DNA. Samakatuwid, ang exponential amplification ay maaaring maobserbahan sa PCR. Maaaring lutasin ang produkto ng PCR gamit ang gel electrophoresis dahil gumagawa ito ng nakikitang dami ng DNA sa isang gel, at maaari itong linisin para sa karagdagang pag-aaral tulad ng sequencing.
Ang PCR ay isang mahalagang tool sa medikal at biological na pananaliksik. Lalo na sa forensic na pag-aaral, ang PCR ay may napakalaking halaga dahil maaari nitong palakihin ang DNA para sa mga pag-aaral mula sa maliliit na sample ng mga kriminal at gumawa ng forensic DNA profile. Ang PCR ay malawakang ginagamit sa maraming lugar ng molecular biology kabilang ang, genotyping, gene cloning, mutation detection, DNA sequencing, DNA microarrays, at paternity testing.
Ano ang Nested PCR Assays?
Ang Nested PCR ay isang uri ng PCR na binabawasan ang hindi partikular na amplification ng DNA. Mayroong dalawang sunud-sunod na PCR o dalawang sequential amplification reactions sa nested PCR assay. Sa unang reaksyon ng amplification, isang produkto ng PCR ang ginawa. Pagkatapos ng unang reaksyon, ang pangalawang reaksyon ng amplification ay isinasagawa sa produkto ng PCR ng unang reaksyon. Samakatuwid, ang mga panimulang aklat sa pangalawang pinaghalong reaksyon ay nagbubuklod sa unang produkto ng PCR at pinalalakas ito.
Figure 02: Nested PCR
Ang mga pares ng primer ay magkakaiba sa bawat reaksyon. Ang di-tiyak na pagbubuklod ng mga panimulang aklat ay nababawasan sa nested PCR. Ang mga nested PCR assay ay kapaki-pakinabang upang mapataas ang sensitivity at/o specificity. Gayunpaman, ang nested PCR ay nangangailangan ng kaalaman tungkol sa interesadong pagkakasunud-sunod.
Ano ang Real-time PCR Assays?
Ang Real-time PCR o quantitative PCR (Q PCR) ay isang binagong bersyon ng PCR na sumusukat sa mga produkto ng PCR sa dami. Samakatuwid, binibilang ng diskarteng ito ang amplification sa real-time gamit ang isang real-time na PCR machine. Ito rin ay isang angkop na paraan para sa pagtukoy ng dami ng isang target na sequence o gene na naroroon sa isang sample.
Ang kawili-wiling tampok ng real-time na PCR ay pinagsasama nito ang parehong amplification at true quantification sa isang hakbang. Samakatuwid, ang pangangailangan para sa gel electrophoresis para sa pagtuklas ay maaaring alisin sa pamamagitan ng real-time na pamamaraan ng PCR. Ang paggamit ng mga fluorescent dyes upang lagyan ng label ang mga produkto ng PCR sa panahon ng mga reaksyon ng PCR ay hahantong sa direktang dami. Kapag ang mga produkto ng PCR ay naipon, ang mga fluorescent signal ay naipon din, at sila ay susukatin ng real-time na makina. Ang SYBR Green at Taqman ay dalawang paraan para makita o mapanood ang proseso ng amplification ng real-time na PCR. Sinusubaybayan ng parehong paraan ang pag-usad ng proseso ng amplification at iniuulat ang dami ng produkto sa real-time.
Figure 03: Real-Time PCR
Ang real-time na PCR ay may malawak na iba't ibang mga application tulad ng gene expression quantification, microRNA at non-coding RNA analysis, SNP genotyping, detection ng mga variant ng copy number, detection ng mga bihirang mutasyon, detection ng genetically modified organisms, at pagtuklas ng mga nakakahawang ahente.
Ano ang Mga Pagkakatulad sa pagitan ng Conventional Nested at Real-time PCR Assays?
- Ang nested at real-time na PCR assay ay mga pagbabago ng conventional PCR assay.
- Lahat ng tatlong pamamaraan ay nagpapalaki ng mga sample ng DNA.
- Maaaring gamitin ang kanilang mga produkto sa sequencing o pagsusuri.
- Ang mga pagsusuring ito ay nangangailangan ng mga panimulang aklat.
Ano ang Pagkakaiba sa pagitan ng Conventional Nested at Real-time PCR Assays?
Ang Conventional PCR ay isang technique na binuo para palakihin ang mga partikular na sequence ng DNA. Samantala, ang Nested PCR ay isang modification ng conventional PCR na binubuo ng dalawang sequential amplification reactions, at ang real-time na PCR ay isang variant ng conventional PCR na kayang ma-quantify ang amplified na produkto. Kaya, ito ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng maginoo na nested at real-time na PCR assays. Hindi tulad ng conventional at real-time na PCR, ang nested PCR ay gumagamit ng dalawang primer set. Bukod dito, mayroong dalawang sunud-sunod na reaksyon ng amplification sa nested PCR upang mabawasan ang hindi tiyak na amplification. bukod pa, hindi naglalaman ng dalawang sequential amplification reaction ang conventional at real-time na PCR assays.
Inililista ng sumusunod na infographic ang mga pagkakaiba sa pagitan ng conventional nested at real-time na PCR assays sa tabular form para sa side by side comparison.
Buod – Conventional vs Nested vs Real-time PCR Assays
Ang Conventional PCR ay ang unang technique na binuo upang palakihin ang mga partikular na fragment ng DNA. Ang nested PCR at real-time na PCR ay dalawang variant ng conventional PCR. Mayroong dalawang sequential amplification reactions at ang paggamit ng dalawang primer set sa nested PCR. Ang real-time na PCR ay binuo upang mabilang ang amplified PCR na produkto. Kaya, ito ay nagbubuod sa pagkakaiba sa pagitan ng maginoo na nested at real-time na PCR assays.
