Mahalagang Pagkakaiba – Mga PCR Primer kumpara sa Sequencing Primer
Sa mga kamakailang pag-unlad sa larangan ng molecular biology, nabuo ang iba't ibang genetic technique na naging madali at tumpak ang mga proseso ng pagsisiyasat sa iba't ibang paraan ng paksa. Ang PCR at iba pang mga pamamaraan ng pagkakasunud-sunod ay dalawang mahalagang mga pamamaraan. Gumagamit sila ng iba't ibang mga subcomponents. Ang mga panimulang aklat ay itinuturing na pangunahing sub-component na karaniwan sa parehong mga diskarte sa PCR at Sequencing. Ginagamit ang mga primer ng PCR para sa pagpapalakas ng isang partikular na pagkakasunud-sunod ng DNA habang ang mga panimulang sequencing ay ginagamit sa konteksto ng pagkakasunud-sunod ng isang fragment ng DNA na may layuning ipakita ang tiyak na pagkakasunud-sunod nito ng pagkakasunud-sunod ng nucleotide. Ito ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng mga PCR primer at sequencing primer.
Ano ang PCR Primer?
Ang Polymerase Chain Reaction (PCR) ay isang genetic technique na ginagamit sa larangan ng molecular biology upang palakihin ang isa o ilang kopya ng isang partikular na segment ng DNA at makakuha ng milyun-milyong magkakaparehong kopya. Sa isang reaksyon ng PCR, iba't ibang bahagi ang ginagamit kabilang ang mga panimulang aklat. Ang mga panimulang aklat ay maiikling mga hibla ng DNA na may haba ng nucleotide na 18-25 na ginagawang tugma ang mga ito sa simula at dulong rehiyon ng mga fragment ng DNA na ipapalaki. Ang mga panimulang aklat ay maaaring maging pasulong na panimulang aklat at reverse primer. Ang mga primer na ito ay nagbubuklod sa fragment ng DNA sa mga partikular na punto kung saan ginagawa nito ang DNA polymerase upang magbigkis sa partikular na primer sa lokasyon at sinisimulan ang synthesis ng bagong DNA strand.
Ang pagpili ng mga panimulang aklat ay isang mahalagang aspeto ng proseso ng PCR. Ang pagpili ng haba ng panimulang aklat ay mahalaga. Ang perpektong haba ay 18-25 nucleotides. Kung ang haba ay masyadong maikli o masyadong mahaba, ang mga panimulang aklat ay hindi magbibigkis sa pagkakasunud-sunod ng DNA upang mapalakas nang tumpak. Ang mga panimulang aklat na masyadong maikli ang haba ay humahantong sa hindi partikular na primer na pagsusubo sa iba't ibang lokasyon ng pagkakasunud-sunod ng DNA.
Figure 01: Mga Primer ng PCR
Ang nilalaman ng Guanine at Cytosine (GC) sa isang magandang primer ay dapat nasa hanay na 40-60. Ang temperatura ng primer na pagsusubo at temperatura ng pagkatunaw ay mahalagang mga kadahilanan sa panahon ng PCR. Dapat na tumpak na kalkulahin ang temperatura ng pagkatunaw, at ang temperatura ng primer na pagsusubo ay dapat na 5 0C na mas mababa kaysa sa temperatura ng pagkatunaw. Ang temperatura ng pagkatunaw ay dapat na 60 °C at 75 °C. Ang masyadong mataas o masyadong mababang temperatura ay magreresulta sa hindi gaanong aktibong aktibidad ng DNA polymerase.
Ano ang Sequencing Primer?
Ang mga sequencing primer ay ginagamit sa konteksto ng pagkakasunud-sunod ng isang fragment ng DNA na may layuning ipakita ang partikular na pagkakakilanlan nito. Upang makakuha ng mahusay na mga resulta ng pagkakasunud-sunod ay mahalaga ang mataas na kalidad na mga primer at template. Kaya, kapag pinili ang mga panimulang aklat, dapat na natatangi ang mga ito sa isang partikular na rehiyon kung saan nais nating i-sequence. Ito rin ay dapat na may tamang oryentasyon kung saan ang mga sequence ay karaniwang nabuo mula 3' hanggang 5' na dulo ng mga primer. Ang pagkakasunud-sunod ay dapat na kulang sa hindi kanais-nais na self-hybridization tulad ng pagbuo ng mga hairpin loop. Hindi ito dapat maglaman ng magkakasunod na pagbuo ng mga base ng Guanine.
Ang temperatura ng pagkatunaw (Tm) ng primer ay dapat na angkop para sa mga kondisyon ng pagkakasunud-sunod. Samakatuwid, dapat itong nasa pagitan ng 52oC at 74oC. Ang paghahanda ng mga oligonucleotides na gagamitin bilang panimulang aklat ay dapat na dalisayin upang makuha ang nais na buong haba ng pagkakasunud-sunod. Kung ang oligonucleotides ay naglalaman ng mga impurities, ang primer sequence signaling ay ipapatong mula sa iba't ibang priming site, at babawasan din nito ang bilang ng mga base cell.
Figure 02: Sequencing Primer
Ang primer na temperatura ng pagkatunaw (Tm) ng isang oligonucleotide ay tumutukoy, kung gaano kalakas ang mga komplementaryong DNA strands ay na-hybrid sa isa't isa. Ang Tm ay maaaring ituring bilang isang thermodynamic na pagkalkula kung saan ito ay nakasalalay sa parehong mga pagkakasunud-sunod ng DNA at ilang mga kondisyon tulad ng konsentrasyon ng asin. Ang Tm ay mahalaga sa panahon ng PCR kung saan ang isang variant na tinatawag na cycle sequencing ay ginagamit upang makabuo ng isang pangkat ng dideoxynucleotide-terminated fragment. Dito, ang panimulang aklat na sequenced ay sa simula ay i-annealed bilang kahalili, pagkatapos ay i-extend at sa wakas ay ide-denatured para sa amplification. Samakatuwid, ang halaga ng Tm ay dapat nasa pagitan ng 52oC at 74o C. Maaaring makuha ang synthesized oligonucleotides mula sa DNA/RNA synthesis laboratories ayon sa pagpili. Ang maliit na sukat ng synthesis na ginagamit para sa DNA sequencing ay karaniwang 50 nmol. Higit sa lahat, ang mga panimulang aklat na ginamit para sa pagkakasunud-sunod ay dapat na linisin upang walang mga impurities na hahadlang sa pagbawas ng kalidad.
Ano ang Mga Pagkakatulad sa pagitan ng PCR Primer at Sequencing Primer?
- Ang mga PCR Primer at Sequencing Primer ay mga primer na ginagamit sa proseso ng amplification ng isang naka-target na DNA sequence.
- Parehong binubuo ng mga nucleotide ang PCR Primer at Sequencing Primer.
- Parehong mga PCR Primer at Sequencing Primer ay maiikling oligomer.
Ano ang Pagkakaiba sa pagitan ng PCR Primer at Sequencing Primer?
PCR Primer vs Sequencing Primer |
|
| Ang PCR primers ay maiikling DNA strand na may haba ng nucleotide sequence na 18-25 na ginagawang tugma ang mga ito sa simula at dulong rehiyon ng mga fragment ng DNA na dapat palakihin. | Ang mga sequencing primer ay maiikling oligomer na ginagamit sa konteksto ng pagkakasunud-sunod ng isang fragment ng DNA na may layuning ibunyag ang partikular na pagkakakilanlan nito. |
| Function | |
| PCR primers ay ginagamit para sa amplification ng isang partikular na DNA sequence. | Ang mga sequencing primer ay ginagamit sa konteksto ng sequencing ng isang fragment ng DNA na may layuning ipakita ang partikular na pagkakakilanlan nito. |
| Bilang ng mga panimulang aklat na Kailangan | |
| Dalawang panimulang aklat; isang forward primer at isang reverse primer ang ginagamit bilang PCR primer. | Kailangan lamang ng isang primer bilang sequencing primer. |
Buod – PCR Primer vs Sequencing Primer
Ang mga sequencing primer ay ginagamit sa konteksto ng pagkakasunud-sunod ng isang fragment ng DNA na may layuning ibunyag ang partikular na pagkakakilanlan nito. Ang isang sequencing primer ay sapat na upang patakbuhin ang proseso. Upang makakuha ng mahusay na mga resulta ng pagkakasunud-sunod, ang mga de-kalidad na primer at template ay mahalaga. Kaya, kapag pinili ang mga panimulang aklat, dapat na natatangi ang mga ito sa isang partikular na rehiyon kung saan nais nating i-sequence. Ang PCR Primers ay maiikling DNA strand na may haba ng nucleotide na 18-25 na tugma sa simula at dulong rehiyon ng mga fragment ng DNA na dapat palakihin. Maaaring maging forward primer at reverse primer ang mga PCR primer. Ang nilalaman ng Guanine at Cytosine (GC) sa isang magandang primer ay dapat nasa hanay na 40-60. Ang temperatura ng panimulang pagsusubo at temperatura ng pagkatunaw ay mahahalagang aspeto sa panahon ng PCR. Ito ang pagkakaiba ng PCR primer at Sequencing primer.
