Mahalagang Pagkakaiba – PCR vs DNA Sequencing
Ang PCR at DNA sequencing ay dalawang mahalagang pamamaraan sa Molecular Biology. Ang Polymerase Chain Reaction (PCR) ay ang proseso na lumilikha ng malaking bilang ng mga kopya ng isang fragment ng DNA. Ang DNA sequencing ay ang pamamaraan na nagreresulta sa tumpak na pagkakasunud-sunod ng mga nucleotide ng isang ibinigay na fragment ng DNA. Ito ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng PCR at DNA sequencing. Ang PCR ay isa sa mga pangunahing hakbang na kasangkot sa DNA sequencing.
Ano ang PCR?
Ang Polymerase Chain Reaction (PCR) ay isang DNA amplification technique na ginagamit sa Molecular Biology. Gumagawa ito ng libu-libo hanggang milyon-milyong kopya ng isang partikular na fragment ng DNA. Ang pamamaraang ito ay binuo ni Kary Mullis noong 1983. Sa pamamaraang ito, ang fragment ng DNA na ipapalaki ang nagsisilbing template at ang DNA polymerase enzyme ay nagdaragdag ng mga pantulong na nucleotides sa primer na magagamit sa PCR mixture. Sa pagtatapos ng reaksyon ng PCR, maraming kopya ng sample na DNA ang na-synthesis.
May iba't ibang bahagi ng PCR mixture, kabilang ang DNA, DNA polymerase (Taq polymerase), mga primer (forward at reverse primer), nucleotides (building blocks ng DNA) at isang buffer. Nangyayari ang PCR sa loob ng isang PCR machine, at ang tamang PCR mixture ay dapat na mai-load sa makina, at ang tamang programa ay dapat na hinihimok. Ang diskarteng ito ay nagbibigay-daan sa paggawa ng libu-libo hanggang milyon-milyong kopya ng isang partikular na seksyon ng DNA mula sa napakaliit na halaga ng DNA.
Ang mga reaksyon ng PCR ay nangyayari sa isang paikot na paraan upang makagawa ng nakikitang dami ng mga produkto ng PCR sa isang gel. Mayroong tatlong pangunahing hakbang na kasangkot sa isang reaksyon ng PCR katulad ng denaturation, primer annealing at strand extension tulad ng ipinapakita sa Figure 01. Ang tatlong hakbang na ito ay nagaganap sa tatlong magkakaibang temperatura. Umiiral ang DNA sa double stranded form ng hydrogen bonds sa pagitan ng mga complementary base. Bago ang implikasyon, ang double stranded na DNA ay dapat na ihiwalay sa isa't isa. Ginagawa ito sa pamamagitan ng pagbibigay ng mataas na temperatura. Sa isang mataas na temperatura, ang double stranded DNA denature sa mga single strand. Kung gayon ang mga panimulang aklat ay dapat lumapit sa mga gilid na dulo ng partikular na fragment o ang gene ng DNA. Ang panimulang aklat ay isang maikling piraso ng single-stranded na DNA na pantulong sa target na sequence. Ang mga forward at reverse primer ay nag-aanne gamit ang mga komplementaryong base sa mga flanking na dulo ng na-denatured na sample na DNA sa temperatura ng pagsusubo. Ang mga panimulang aklat ay dapat na lumalaban sa init. Kapag na-anne na ang mga primer na may sample na DNA, ang taq polymerase enzyme ay magsisimula ng synthesis ng mga bagong strand sa pamamagitan ng pagdaragdag ng mga nucleotide na pantulong sa target na DNA. Ang Taq polymerase ay isang heat stable na enzyme na nakahiwalay sa isang thermophilic bacterium na tinatawag na Thermus aquaticus. Pinapanatili ng PCR buffer ang pinakamainam na kondisyon para sa pagkilos ng taq polymerase. Ang tatlong yugto ng mga reaksyon ng PCR ay paulit-ulit upang makagawa ng kinakailangang dami ng produkto ng PCR. Pagkatapos ng bawat reaksyon ng PCR, nadodoble ang bilang ng kopya ng DNA. Samakatuwid, ang isang exponential amplification ay maaaring maobserbahan sa PCR. Maaaring obserbahan ang mga produkto ng PCR gamit ang gel electrophoresis at maaaring linisin para sa karagdagang pag-aaral.
Figure 01: Mga Pangunahing Hakbang ng PCR Reaction
Ang PCR ay isang mahalagang tool sa medikal at biological na pananaliksik. Ang PCR ay may espesyal na halaga sa forensic science dahil maaari nitong palakihin ang DNA para sa mga pag-aaral mula sa maliliit na sample mula sa mga kriminal at gumawa ng forensic DNA profile. Ang PCR ay malawakang ginagamit sa maraming lugar ng molecular biology kabilang ang, genotyping, gene cloning, mutation detection, DNA sequencing, DNA microarrays at paternity testing, atbp.
Figure 02: Polymerase Chain Reaction
Ano ang DNA Sequencing?
Ang DNA sequencing ay ang pagtukoy ng isang tumpak na pagkakasunud-sunod ng mga nucleotides – adenine, guanine, cytosine at thymine sa isang partikular na fragment ng DNA. Ang genetic na impormasyon ay nakaimbak sa mga sequence ng DNA gamit ang tamang pagkakasunud-sunod ng mga nucleotide. Kaya naman, ang paghahanap ng tumpak na pagkakasunud-sunod ng mga nucleotide sa isang fragment ng DNA ay napakahalagang malaman ang tungkol sa istraktura at paggana ng mga gene.
Ang DNA sequencing protocol ay nagsasangkot ng iba't ibang proseso. Ang unang hakbang ay ang paghihiwalay ng interesadong DNA o genomic DNA ng isang organismo. Gamit ang PCR (tulad ng inilarawan sa itaas), ang nais na rehiyon ng DNA ay dapat na palakihin. Ang produkto ng amplified PCR ay dapat ihiwalay ng gel electrophoresis at purified. Ang mga amplified na fragment ay inihahain bilang mga template para sa sequencing. Maaaring gawin ang pagkakasunud-sunod alinman sa pagsunod sa Sanger sequencing o high throughput sequencing na paraan. Ang pagkakasunud-sunod ng Sanger ay nangangailangan ng capillary electrophoresis ng mga nagresultang mga fragment ng DNA. Ang pagtukoy sa tamang pagkakasunud-sunod ng nucleotide ay maaaring gawin sa pamamagitan ng manu-manong pagbabasa ng mga autoradiograph o paggamit ng mga awtomatikong DNA sequencer.
Gene sequencing ay nag-ambag sa Human genome project at pinadali ang pagmamapa ng human genome noong 2003. Sa forensics, pinagana ng DNA sequencing ang pagkakakilanlan ng mga indibidwal na nagpapakita ng mga natatanging sequence ng DNA at nakikilala ang mga kriminal. Sa medisina, ang DNA sequencing ay maaaring gamitin upang makita ang mga gene na responsable para sa genetic at iba pang mga sakit, hanapin ang mga depektong gene at palitan ang mga ito ng mga tamang gene. Sa agrikultura, ginagamit ang impormasyon sa pagkakasunud-sunod ng DNA ng ilang microorganism upang makagawa ng mga transgenic na pananim na may mga katangiang gustong matipid.
Figure 03: DNA Sequencing
Ano ang pagkakaiba ng PCR at DNA Sequencing?
PCR vs DNA Sequencing |
|
| Ang proseso ng PCR ay lumilikha ng libu-libo hanggang milyun-milyong kopya ng interesadong DNA fragment. | Ang DNA sequencing ay ang proseso ng pagtukoy sa tumpak na pagkakasunud-sunod ng mga nucleotide sa isang partikular na fragment ng DNA. |
| Kinalabasan | |
| PCR ay lumilikha ng libu-libo hanggang milyon-milyong kopya ng isang partikular na fragment ng DNA | Nagreresulta ito sa tamang pagkakasunud-sunod ng mga base sa isang partikular na fragment ng DNA. |
| Paglahok ng mga ddNTP | |
| Ang PCR ay hindi nangangailangan ng mga ddNTP. Gumagamit ito ng mga dNTP. | DNA sequencing ay nangangailangan ng mga ddNTP upang wakasan ang strand formation. |
Buod – PCR vs DNA Sequencing
Ang PCR at DNA sequencing ay napakahalagang kasangkapan sa maraming bahagi ng Molecular Biology. Ang amplification ng mga fragment ng DNA ay ginagawa ng PCR technique habang ang tamang pagkakasunud-sunod ng mga nucleotides ng isang DNA fragment ay tinutukoy ng DNA sequencing. Ito ang pagkakaiba sa pagitan ng PCR at DNA sequencing.
