Mahalagang Pagkakaiba – Northern vs Southern vs Western Blotting
Ang pagtuklas ng mga partikular na sequence ng DNA, RNA, at mga protina ay mahalaga para sa iba't ibang uri ng pag-aaral sa Molecular biology. Ang gel electrophoresis ay isang pamamaraan na naghihiwalay sa DNA, RNA, at mga protina ayon sa kanilang mga sukat. Mula sa mga profile ng gel, ang partikular na pagkakasunud-sunod ng DNA, pagkakasunud-sunod ng RNA, o protina ay nakita ng mga espesyal na pamamaraan na tinatawag na blotting at hybridization na may mga label na probes. Mayroong tatlong iba't ibang uri ng mga pamamaraan ng blotting katulad ng southern, northern at western. Ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng hilagang timog at western blotting ay nakasalalay sa uri ng molekula na nakita nito mula sa isang sample. Ang Southern blotting ay isang paraan kung saan nakikita ang isang partikular na sequence ng DNA mula sa isang sample ng DNA. Ang Northern blotting ay isang pamamaraan na nakakakita ng isang partikular na RNA sequence mula sa isang sample ng RNA. Ang Western blotting ay isang paraan na nakakakita ng partikular na protina mula sa sample ng protina.
Ano ang Southern Blotting?
Ang Southern blotting technique ay binuo ng E. M. Southern noong 1975 para sa pagtukoy ng isang partikular na sequence ng DNA mula sa isang sample ng DNA. Ito ang unang pamamaraan ng blotting na ipinakilala sa molecular biology. Pinagana nito ang pagtuklas ng mga partikular na gene mula sa DNA, mga partikular na fragment mula sa DNA, atbp. Mayroong ilang mga hakbang na kasangkot sa pamamaraan ng southern blotting. Ang mga ito ay ang mga sumusunod.
- Ang DNA ay nakahiwalay sa sample at natutunaw gamit ang restriction endonucleases.
- Ang natunaw na sample ay pinaghihiwalay ng Agarose gel electrophoresis.
- Ang mga fragment ng DNA sa gel ay na-denatured sa mga single strand sa pamamagitan ng paggamit ng alkaline solution.
- Ang solong stranded na DNA ay inililipat sa isang nitrocellulose filter membrane sa pamamagitan ng paglilipat ng capillary.
- Ang inilipat na DNA ay permanenteng naayos sa lamad.
- Naka-hybridize ang nakapirming DNA sa lamad gamit ang mga may label na probe.
- Ang hindi nakatali na DNA ay nahuhugasan mula sa lamad sa pamamagitan ng paghuhugas.
- Ang X-ray film ay nakalantad sa lamad at naghahanda ng autoradiograph.
Southern blotting ay inilalapat para sa iba't ibang aspeto ng molecular biology. Ito ay kapaki-pakinabang sa RFLP mapping, forensic studies, DNA methylation sa gene expression, detection ng mutated genes sa genetic disorders, DNA fingerprinting, atbp.
Figure 01: Southern Blotting Technique
Ano ang Northern Blotting?
Ang Northern blotting ay isang paraan na idinisenyo upang makita ang isang partikular na RNA sequence o mRNA sequence mula sa isang sample upang pag-aralan ang expression ng gene. Ang diskarteng ito ay binuo nina Alwine, Kemp, at Stark noong 1979. Naiiba ito sa sourthern at western blotting techniques dahil sa ilang hakbang. Gayunpaman, ang diskarteng ito ay ginagawa din sa pamamagitan ng gel electrophoresis, blotting, at hybridization na may mga partikular na may label na probes at detection. Isinasagawa ang Northern blotting technique bilang mga sumusunod.
- Ang RNA ay kinuha mula sa sample at pinaghihiwalay ng gel electrophoresis.
- Ang RNA ay inililipat mula sa gel papunta sa isang blotting membrane at inayos.
- Ang lamad ay ginagamot gamit ang isang may label na probe na inihanda mula sa cDNA o RNA (ang probe ay pandagdag sa isang partikular na pagkakasunud-sunod sa sample).
- Ang probe ay inilublob sa lamad upang magbigkis nang may partikular na pagkakasunod-sunod.
- Ang mga hindi nakatali na probe ay inalis.
- Naka-detect ang mga hybrid na fragment ng autoradiograph.
Ang northern blotting ay isang mahalagang tool sa pag-detect at quantification ng hybridized mRNA, pag-aaral ng RNA degradation, evaluation ng RNA half-life, detection ng RNA splicing, pag-aaral ng gene expression, atbp.
Figure 02: Northern Blotting
Ano ang Western Blotting?
Ang Western blotting ay isang paraan ng pagtukoy ng isang partikular na protina mula sa pinaghalong protina sa pamamagitan ng paggamit ng may label na antibody. Samakatuwid, ang western blot ay kilala rin bilang immunoblot. Ang pamamaraan na ito ay ipinakilala ni Towbin et al noong 1979 at ito ay regular na ginagawa sa mga lab para sa pagsusuri ng protina. Ang mga hakbang ay ang mga sumusunod.
- Ang mga protina ay nakuha mula sa sample
- Ang mga protina ay pinaghihiwalay ayon sa kanilang mga sukat gamit ang polyacrylamide gel electrophoresis
- Ang mga hiwalay na molekula ay inililipat sa isang PVDF membrane o nitrocellulose membrane sa pamamagitan ng electroporation
- Naharang ang lamad para sa hindi tiyak na pagbubuklod sa mga antibodies
- Ang mga inilipat na protina ay nakatali sa pangunahing antibody (mga antibodies na may label na enzyme).
- Ang lamad ay hinuhugasan upang alisin ang hindi partikular na nakagapos na mga pangunahing antibodies
- Natutukoy ang mga nakagapos na antibodies sa pamamagitan ng pagdaragdag ng substrate at pag-detect ng may kulay na precipitate na nabuo
Ang Western blotting ay kapaki-pakinabang sa pagtuklas ng mga anti-HIV antibodies sa sample ng serum ng tao. Maaari ding gamitin ang Western blot bilang confirmatory test para sa Hepatitis B infection at definitive test para sa mad cow disease.
Figure 03: Western Blotting
Ano ang pagkakaiba ng Northern Southern at Western Blotting?
Northern vs Southern vs Western Blotting |
|
| Uri ng Molecule na Nakita | |
| Northern Blotting | Northern blotting ay may nakitang partikular na RNA sequence mula sa isang RNA sample. |
| Southern Blotting | Nakatukoy ang Southern blotting ng isang partikular na sequence ng DNA mula sa sample ng DNA. |
| Western Blotting | Western blotting ay may nakitang partikular na protina mula sa sample ng protina. |
| Uri ng Gel | |
| Northern Blotting | Gumagamit ito ng Agarose/formaldehyde gel. |
| Southern Blotting | Gumagamit ito ng Agarose gel. |
| Western Blotting | Gumagamit ito ng Polyacrylamide gel. |
| Paraan ng Blotting | |
| Northern Blotting | Ito ay isang capillary transfer. |
| Southern Blotting | Ito ay isang capillary transfer. |
| Western Blotting | Ito ay isang electric transfer. |
| Mga Ginamit na Probe | |
| Northern Blotting | cDNA o RNA probe na may label na radioactive o nonradioactively. |
| Southern Blotting | Ang DNA probe ay may label na radioactive o non-radioactively. |
| Western Blotting | Ang pangunahing antibodies ay ginagamit bilang mga probe. |
| Detection System | |
| Northern Blotting | Ginagawa ito gamit ang autoradiograph, o pagtuklas ng liwanag o pagbabago ng kulay. |
| Southern Blotting | Ginagawa ito gamit ang autoradiograph, pagtukoy ng liwanag o pagbabago ng kulay. |
| Western Blotting | Ginagawa ito gamit ang pagtukoy ng liwanag o pagbabago ng kulay. |
Buod – Northern vs Southern vs Western Blotting
Ang Blotting ay isang espesyal na pamamaraan na binuo para sa pagtukoy ng partikular na DNA, RNA o protina mula sa mga sample. Mayroong tatlong magkakahiwalay na pamamaraan ng blotting, katulad ng hilaga, timog at kanluran, upang makita ang isang partikular na uri ng molekula. Ang Northern blotting technique ay idinisenyo upang makita ang isang partikular na RNA sequence mula sa pinaghalong RNA. Binibigyang-daan ng Southern blotting technique ang pagtuklas ng isang partikular na sequence ng DNA mula sa isang sample ng DNA at ang western blotting technique ay binuo para matukoy ang isang partikular na protina mula sa isang pinaghalong protina.
