Mahalagang Pagkakaiba – Blunt vs Sticky End Ligation
Restriction endonucleases ay mga partikular na enzyme na pumuputol ng double-stranded DNA (dsDNA). Ang mga ito ay kilala rin bilang molecular scissors sa Molecular biology. Nakikilala ng mga restriction enzymes ang mga partikular na maiikling sequence ng dsDNA na kilala bilang recognition sites at pinuputol ang mga phosphodiester at hydrogen bond para magbukas ng double strands. Bilang resulta ng cleavage ng mga enzyme na ito, ang mga fragment ng DNA ay ginawa na may iba't ibang uri ng mga dulo tulad ng malagkit na dulo at mapurol na dulo. Ang DNA ligase ay isang enzyme na ginagamit sa Molecular biology upang pagsamahin ang dalawang magkatabing hibla ng DNA sa pamamagitan ng pagbuo ng mga bagong bono. Ang hakbang ay kilala bilang ligation at ayon sa uri ng DNA end ligated, maaari silang tawagin bilang blunt end ligation at sticky end ligation. Ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng blunt at sticky end ligation ay ang blunt end ligation ay nangyayari sa pagitan ng mga fragment ng DNA na naglalaman ng dalawang blunt na dulo samantalang ang sticky end ligation ay nangyayari sa pagitan ng 5' at 3' overhang. Kung ikukumpara sa blunt end ligation, ang sticky end ligation ay mas mahusay at stable.
Ano ang Blunt End Ligation?
Maaaring putulin ng ilang restriction endonucleases ang DNA sa magkabilang base at makagawa ng mga blunt end fragment ng DNA. Ang mga enzyme na ito ay kilala bilang mga blunt end cutter; dumiretso sila pababa sa gitna ng restriction site nang hindi nag-iiwan ng nag-iisang stranded overhanging base. Ang mga blunt end ay kilala rin bilang non-overhanging ends dahil wala silang 3' at 5' overhanging base sa mga dulo. Ang parehong mga hibla ay nagtatapos mula sa mga pares ng base sa mapurol na mga dulo. Ang mga karaniwang blunt end cutting enzyme ay EcoRV HaeIII, AluI at SmaI.
Blunt end ligation ay kasangkot sa pagitan ng dalawang mapurol na dulo. Ito ay hindi isang ligation ng nakausli na mga base. Ang ligation na ito ay hindi gaanong mahusay kaysa sa sticky end ligation. Gayunpaman, sa ilang mga pagkakataon, ang blunt end ligation ay nagiging mas kapaki-pakinabang kaysa sa sticky end ligation, lalo na kapag nag-ligat ng mga produkto ng PCR. Palaging ginagawa ang mga produktong PCR na may mapurol na dulo. Ang blunt end ligation ay hindi nangangailangan ng complementary ends sa DNA para sa ligation.
Figure 01: Blunt end production ng Eco RV enzyme
Ano ang Sticky End Ligation?
Nagagawa ng ilang restriction endonucleases na putulin ang dsDNA, na nag-iiwan ng nakasabit na piraso ng single-stranded DNA sa dulo. Ang mga dulong ito ay kilala bilang malagkit o nakasabit na mga dulo. Ang malagkit na dulong ligation ay nangyayari sa pagitan ng dalawang fragment ng DNA na naglalaman ng magkatugmang mga overhang dahil ang mga malagkit na dulo ay nagtataglay ng hindi magkapares na mga base at nangangailangan ng mga pantulong na base upang bumuo ng mga bono. Kaya naman, kinakailangang gumamit ng parehong restriction enzyme para sa parehong pinagmumulan ng DNA para makagawa ng magkatugmang ligating fragment.
Ang sticky end ligation ay mas mahusay at kadalasang lubhang kanais-nais sa mga proseso ng pag-clone. Mayroong ilang mga restriction enzymes na gumagawa ng malagkit na dulo. Ang mga ito ay EcoRI, BamHI, HindIII atbp.
Figure 02: Sticky end production ng Eco RI enzyme
Ano ang pagkakaiba ng Blunt at Sticky End Ligation?
Blunt vs Sticky End Ligation |
|
| Ang blunt end ligation ay nangyayari sa pagitan ng dalawang blunt end fragment ng DNA. | Nagkakaroon ng sticky end ligation sa pagitan ng dalawang magkatugmang DNA fragment na may malagkit na dulo. |
| Enzymes | |
| Ang mga blunt end cutter ay gumagawa ng mga blunt na dulo. | Ang mga sticky end cutter ay gumagawa ng malagkit o magkakaugnay na dulo. |
| Nangangailangan ng Pagtutugma ng mga Pagtatapos | |
| Hindi ito nangangailangan ng pagtutugma ng mga fragment o komplementaryong base. | Nangangailangan ito ng mga pantulong na base sa mga dulo upang makabuo ng mga pares ng base. |
| Kahusayan | |
| Hindi gaanong mahusay kaysa sa sticky end ligation | Ito ay mas mahusay kaysa sa blunt end ligation. |
Buod – Blunt vs Sticky End Ligation
Restriction endonucleases ay nakakapag-cleave ng dsDNA at gumagawa ng mga fragment ng DNA na may iba't ibang dulo. Kinikilala nila ang mga tiyak na pagkakasunud-sunod at pinaghihigpitan ang DNA na lumilikha ng malagkit at mapurol na mga dulo. Ang mga malagkit na dulo ay may hindi magkapares na mga base sa dulo ng mga fragment. Ang mga mapurol na dulo ay nilikha dahil sa isang tuwid na cleavage at mayroon silang mga pares ng base sa mga dulo. Ang sticky end ligation ay nangangailangan ng dalawang komplementaryong single-stranded na piraso ng DNA. Ang blunt end ligation ay nangyayari sa pagitan ng alinmang dalawang blunt end fragment. Ito ang pagkakaiba sa pagitan ng mapurol at malagkit na ligation.
