Ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng Golden Gate at Gibson Assembly ay ang Golden Gate ay umaasa sa pagkakaroon ng mga restriction site sa loob ng isang partikular na pagkakasunud-sunod upang mai-clone, habang ang Gibson Assembly ay hindi umaasa sa presensya ng mga restriction site sa loob ng isang partikular na pagkakasunod-sunod upang ma-clone.
Sa nakalipas na mga dekada, nakabuo ang mga molecular scientist ng iba't ibang standardized procedure na nagbibigay-daan sa mas madaling pag-assemble ng maraming fragment ng DNA sa iisang piraso. Samakatuwid, ang mga paraan ng pag-clone tulad ng Restriction Enzyme Ligation, Gateway Cloning, Gibson Assembly, Golden Gate Assembly, at TOPO Cloning ay malawakang ginagamit ng mga mananaliksik sa mga siyentipikong eksperimento. Samakatuwid, ang Golden Gate at Gibson Assembly ay dalawang molecular cloning method na nagbibigay-daan sa pag-assemble ng maraming fragment ng DNA sa isang piraso.
Ano ang Golden Gate Assembly?
Ang Golden Gate ay isang molecular cloning method na nagpapadali sa pag-assemble ng maraming fragment ng DNA sa iisang piraso. Ang pamamaraang ito ay umaasa sa pagkakaroon ng mga site ng paghihigpit sa loob ng isang partikular na pagkakasunud-sunod upang mai-clone. Nagmula ito noong 1996. Ang pamamaraan na ito ay gumagamit ng Type IIS restriction enzymes at T4 DNA ligase. Pinutol ng mga enzyme na ito ang DNA sa labas ng mga lugar ng pagkilala. Maaari silang lumikha ng mga di-palindromic na overhang. Samakatuwid, maraming fragment ng DNA ang maaaring tipunin gamit ang mga kumbinasyon ng mga overhang sequence.
Figure 01: Golden Gate
Golden Gate Assembly Procedure
Ang pamamaraan ng Golden Gate ay may pangunahing tatlong hakbang sa pamamaraan nito:
- paglikha ng mga overhang sa cloning vector,
- assembly ng maraming pagsingit ng DNA sa pamamagitan ng paggamit ng mga fragment-specific na sequence sa mga overhang, at
- ligation.
Golden Gate assembly ay gumagamit ng circular cloning vectors (destination vector). Higit pa rito, sa pamamaraang ito, ang lugar ng paghihigpit ay inalis mula sa ligated na produkto upang maisagawa ang panunaw at ligation nang sabay-sabay. Ang isang tipikal na thermal cycle protocol para sa Golden Gate ay umuusad sa pagitan ng 37 °C at 16 °C dahil ang 37 °C ay pinakamainam para sa restriction enzymes at 16 °C ay pinakamainam para sa mga ligase.
Ano ang Gibson Assembly?
Ang Gibson Assembly ay isang molecular cloning method na nagbibigay-daan sa pag-assemble ng maraming fragment ng DNA sa iisang piraso. Hindi tulad ng pamamaraang Golden Gate, ang pamamaraang ito ay hindi umaasa sa pagkakaroon ng mga restriction site sa loob ng isang partikular na pagkakasunud-sunod upang mai-clone. Natagpuan ito ni Daniel G. Gibson ng J. Craig Venter Institute. Ang technique na ito ay isang uri ng sequence at ligase independent cloning (SLIC) method.
Figure 02: Gibson Assembly
Gibson Assembly Procedure
Gibson Assembly ay nangangailangan ng mga fragment ng DNA na naglalaman ng 20-40 pares ng base na nagsasapawan sa katabing mga fragment ng DNA. Nagdaragdag ng mga overlap sa pamamagitan ng PCR. Pagkatapos ang mga fragment ng DNA na ito ay idinagdag sa pinaghalong Gibson maser na mayroong tatlong enzyme. Isinasagawa ang pamamaraang ito sa ilalim ng isothermal na kondisyon (50 °C sa loob ng 1 oras) gamit ang tatlong magkakaibang enzyme: exonuclease, DNA polymerase at DNA ligase. Ang exonuclease ay ngumunguya pabalik ng DNA mula sa dulo ng 5'. Kaya, hindi nito pinipigilan ang aktibidad ng polymerase at pinapayagan ang reaksyon na magpatuloy sa isang solong proseso. Ang nagreresultang mga single-stranded na rehiyon sa katabing mga fragment ng DNA ay maaaring ma-annealed dahil sa mga magkakapatong na pagkakasunud-sunod. Pinupuno ng DNA polymerase ang mga puwang sa pamamagitan ng pagdaragdag ng mga nucleotide. Sa wakas, ang DNA ligase ay covalently na sumasali sa DNA ng mga katabing segment. Karaniwan, ang Gibson Assembly ay gumagamit ng mga linearized na vector ng patutunguhan. Bukod dito, ang pamamaraang ito ay maaaring sabay-sabay na pagsamahin ang hanggang 15 fragment ng DNA batay sa pagkakapareho ng pagkakasunud-sunod.
Mga Pagkakatulad sa pagitan ng Golden Gate at Gibson Assembly
- Golden Gate at Gibson Assembly ay dalawang molecular cloning method.
- Ang parehong paraan ay maaaring mag-assemble ng maraming fragment ng DNA sa isang piraso.
- Gumagamit ang mga paraang ito ng mga destination vector.
- Ang parehong mga pamamaraan ay gumagamit ng mga thermal cycler para sa pag-assemble ng maramihang mga fragment ng DNA.
- Ginagamit ang mga ito sa mutagenesis na nakadirekta sa site.
Pagkakaiba sa pagitan ng Golden Gate at Gibson Assembly
Ang Golden Gate ay isang molecular cloning method na ginagamit sa pag-assemble ng maramihang mga fragment ng DNA sa isang piraso na umaasa sa pagkakaroon ng mga restriction site sa loob ng isang partikular na sequence na i-clone, habang ang Gibson Assembly ay isang molecular cloning method na ginagamit sa pagpupulong ng maramihang mga fragment ng DNA sa isang piraso nang hindi umaasa sa pagkakaroon ng mga restriction site sa loob ng isang partikular na pagkakasunud-sunod upang mai-clone. Ito ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng Golden Gate at Gibson Assembly. Higit pa rito, gumagamit ang Golden Gate method ng circular destination vector, habang ang Gibson Assembly method ay gumagamit ng linearized destinations vector.
Itinatala ng sumusunod na infographic ang pagkakaiba sa pagitan ng Golden Gate at Gibson Assembly.
Buod – Golden Gate vs Gibson Assembly
Ang Molecular cloning ay isang paraan na ginagamit upang tipunin ang mga recombinant na molekula ng DNA at idirekta ang kanilang pagtitiklop sa loob ng mga host organism. Ang Golden Gate at Gibson Assembly ay dalawang molecular cloning method na nagbibigay-daan sa pag-assemble ng maramihang mga fragment ng DNA sa iisang piraso. Ang pamamaraan ng Golden Gate ay umaasa sa pagkakaroon ng mga restriction site sa loob ng isang partikular na sequence na i-clone, habang ang Gibson Assembly ay hindi umaasa sa presensya ng mga restriction site sa loob ng isang partikular na sequence na i-clone. Kaya, ito ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng Golden Gate at Gibson Assembly.
