Mahalagang Pagkakaiba – SYBR Green vs Taqman
Ang SYBR Green at Taqman ay dalawang paraan na ginagamit upang makita o mapanood ang proseso ng amplification ng real-time na PCR. Ang SYBR Green ay isang paraan batay sa intercalating nucleic acid staining dye habang ang Taqman ay isang paraan batay sa hydrolysis probe. Ang parehong mga teknolohiya ay idinisenyo upang makabuo ng fluorescence sa panahon ng PCR, na nagbibigay-daan sa real-time na PCR machine na subaybayan ang reaksyon sa "real time". Ang pamamaraang SYBR Green ay isinasagawa gamit ang fluorescent dye na tinatawag na SYBR green at nakikita ang amplification sa pamamagitan ng pagbubuklod sa dye upang makagawa ng double stranded DNA. Isinasagawa ang Taqman gamit ang dual-labeled probes at nakikita ang amplification sa pamamagitan ng degradation ng probe ng Taq polymerase at mga paglabas ng fluorophore. Ito ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng SYBR Green at Taqman.
Ano ang SYBR Green?
Ang SYBR Green ay isang fluorescent dye na ginagamit upang mantsa ng mga nucleic acid, lalo na ang double stranded DNA sa Molecular Biology. Ginagamit ang SYBR Green na pamamaraan upang mabilang ang mga produkto ng PCR sa panahon ng real-time na PCR. Kapag ito ay nagbubuklod sa DNA, ang nagreresultang DNA-dye complex ay sumisipsip ng asul na liwanag at naglalabas ng matinding berdeng ilaw. Nangyayari ito dahil sa pagbabago sa istruktura na nangyayari sa molekula ng dye kapag nagbubuklod sa double-stranded na DNA. Kapag ang PCR ay lumilikha ng mas maraming DNA, mas maraming dye molecule ang nagbubuklod sa DNA, na bumubuo ng mas maraming fluorescence. Samakatuwid, ang pag-ilaw ay tumataas sa akumulasyon ng produkto ng PCR. Kaya naman, ang dami ng produkto ng PCR ay masusukat sa dami ng SYBR Green fluorescence detection.
SYBR green dye ay maaari ding gamitin para sa DNA labeling sa cytometry at fluorescent microscopy. Ang Ethidium bromide ay matagumpay na napalitan ng SYBR Green dahil ang Ethidium bromide ay isang carcinogenic dye na may mga problema sa pagtatapon sa panahon ng visualization ng DNA sa gel electrophoresis.
May mga pakinabang at disadvantages ng SYBR green method. Ang pamamaraang ito ay napaka-sensitibo, mura at madaling gamitin. Gayunpaman, dahil sa kakayahang magbigkis sa anumang double-stranded na DNA, ang hindi tiyak na pagbubuklod ay maaaring humantong sa sobrang dami ng produkto ng PCR.
Figure 01: SYBR Green Technique
Ano ang Taqman?
Ang Taqman ay isang alternatibong paraan sa SYBR Green para masubaybayan ang real-time na proseso ng PCR. Ang pamamaraang ito ay nakasalalay sa 5' - 3' exonuclease na aktibidad ng Taq polymerase enzyme upang pababain ang mga probes sa panahon ng pagpapalawig ng bagong strand at paglabas ng fluorophore. Ginagamit ang dalawahang may label na probes sa pamamaraang ito at ito ay batay sa hydrolysis ng mga probe. Ang mga probe ay may fluorescently na may label na DNA oligonucleotides na mayroong fluorescent reporter molecule (fluorophore) sa dulong 5’ at isang quencher molecule sa dulong 3’. Ang mga ito ay idinisenyo upang magbigkis sa nag-iisang stranded na template sa kabaligtaran ng mga primer na anneal. Ang Taq polymerase ay nagdaragdag ng mga nucleotide sa panimulang aklat at pinapalawak ang bagong strand patungo sa dalawahang may label na probes. Kapag natugunan ng Taq polymerase ang probe, ang pagkilos ng exonuclease ng Taq polymerase ay nag-a-activate at nagpapababa sa probe. Kapag nakumpleto na nito ang synthesis ng bagong strand, ang probe ay sasailalim sa kumpletong pagkasira at ilalabas ang fluorophore. Ang paglabas ng fluorophore ay bumubuo ng fluorescence. Ang molekula ng Fluorescent Quencher ay mahusay na pinapatay ang ibinubuga na ilaw at lumilikha ng output para sa quantification ng produkto ng PCR. Ang paglabas ng mga fluorophores at dami ng mga produkto ng PCR ay proporsyonal. Kaya naman, madaling gawin ang quantification sa pamamagitan ng pamamaraang Taqman.
Figure 02: Paraan ng Taqman
Ginagamit ang paraan ng Taqman sa real time PCR, quantification ng gene expression, detection ng genetic polymorphism, quantification ng chromosomal DNA deletion, bacterial identification, verification ng microarray analysis, SNP genotyping atbp.
Ano ang pagkakaiba ng SYBR green at Taqman?
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Green ay batay sa DNA binding dye. | Depende ang Taqman sa hybridization probe at 5’ hanggang 3’ exonuclease activity ng Taq polymerase. |
| Fluorescently Labeled Probes | |
| Walang fluorescently na may label na probe ay hindi kinakailangan. | Kinakailangan ang mga probe na may dalawahang label. |
| Multiplex Gene Analysis | |
| Hindi ito magagamit para sa mga target na multiplex gene. | Maaari itong gamitin para sa mga target na multiplex gene. |
| Gastos | |
| Ito ay mas mura. | Mas mahal ito. |
| Specificity | |
| Ito ay hindi gaanong tiyak at nagbubuklod sa anumang double strand DNA | Ang mga ito ay lubos na partikular dahil nakita ng mga probe ang mga partikular na produkto ng amplification. |
| Effectiveness | |
| Hindi gaanong epektibo ito. | Ito ay lubos na epektibo. |
| Application | |
| Ginagamit ito sa real-time na PCR, agarose gel visualization, DNA labeling atbp. | Ginagamit ito sa real time PCR, quantification ng gene expression, detection ng genetic polymorphism, atbp. |
Buod – SYBR Green at Taqman
Ang Taqman at SYBR green ay dalawang paraan na ginagamit sa real-time na PCR (quantitative PCR). Ang parehong mga pamamaraan ay nagbibigay-daan sa pag-quantification ng produkto ng PCR nang mahusay at umaasa sa paglabas ng fluorescence. Gumagamit ang pamamaraan ng Taqman ng dalawahang may label na probes para sa pagtuklas ng naipon na DNA habang ang pamamaraan ng SYBR Green ay gumagamit ng fluorescent dye. Ang parehong mga pamamaraang ito ay mayroon ding magkaibang aplikasyon sa molecular biology.
